1、衣藻葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白lba基因?qū)ζ洚a(chǎn)氫影響的初步研究,成珍,豆血紅蛋白,存在于大豆根瘤中的根瘤菌(以類(lèi)菌體的形式存在)的固氮酶對(duì)氧十分敏感，必須在兼氧的條件下才有固氮的活性，在高氧或者無(wú)氧的環(huán)境中是沒(méi)有活性的.但是存在于根瘤菌周?chē)亩寡t蛋白可與氧進(jìn)行可逆性結(jié)合，在類(lèi)菌體的周?chē)鹧蹙彌_的作用，成為阻止過(guò)多的游離氧接觸固氮酶的屏障，豆血紅蛋白還作為氧的載體，負(fù)擔(dān)著在低氧環(huán)境中為類(lèi)菌體呼吸提供氧的任務(wù)，使固氮酶免受氧的損害，保持高效的固氮活性。因此本研究將豆血紅蛋白轉(zhuǎn)入衣藻葉綠體中表達(dá)，利用豆血紅蛋白與氧氣可逆結(jié)合的性質(zhì)，嘗試在衣藻葉綠體中模擬大豆根瘤細(xì)胞的環(huán)境，創(chuàng)造一個(gè)低氧氣環(huán)境的同時(shí)，結(jié)

2、合部分抑制PSII活性的措施；提高光合電子傳遞效率，提高衣藻產(chǎn)氫效率。,衣藻葉綠體外源基因的轉(zhuǎn)化原理,外源基因轉(zhuǎn)化入衣藻葉綠體時(shí)是通過(guò)同源重組方式即靠基因的同源片段的雙交換方式定點(diǎn)將外源基因置換到衣藻葉綠體上。在構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí)，外源基因表達(dá)盒的前后分別連接有衣藻葉綠體基因組的同源片斷，當(dāng)載體進(jìn)入葉綠體后，同源片斷與受體基因組相應(yīng)的片斷發(fā)生同源重組，外源基因被整合到葉綠體的特定位點(diǎn)，隨葉綠體基因復(fù)制和遺傳，可以消除核轉(zhuǎn)化的“位置效應(yīng)”造成對(duì)基因表達(dá)的不利影響，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá),衣藻葉綠體外源基因轉(zhuǎn)化的方法,萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化的方法主要有基因槍法和電擊法?；驑尫ㄓ址Q(chēng)高速微粒轟擊法，是在真空室中

3、利用基因槍傳遞的高壓氦氣加速包被著DNA片斷的金屬微粒(金粉或鎢粉)轟擊受體細(xì)胞，這種方法轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、適用于各種細(xì)胞類(lèi)型，因而可用于衣藻的核轉(zhuǎn)化、葉綠體轉(zhuǎn)化和線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)化。電擊法又稱(chēng)電脈沖法，是利用脈沖電場(chǎng)瞬間作用改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，形成可逆的瞬間通道，外源DNA通過(guò)通道進(jìn)入細(xì)胞。該法操作簡(jiǎn)單快速、轉(zhuǎn)化效率高、無(wú)菌操作容易控制，也常常用于細(xì)菌和高等植物的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率同玻璃珠法相似。,實(shí)驗(yàn)方法,豆血紅蛋白基因的克隆 大豆總RNA的提取 稱(chēng)取大豆成熟的根瘤o1g，液氮研磨，抽提大豆的總RNA RNA濃度和純度的檢測(cè)將總RNA稀釋50倍左右，用紫外分光光度計(jì)(Eppendo

4、rfBioPhotometer) 讀取)OD260和OD280值，計(jì)算RNA濃度和純度。,豆血紅蛋白基因lba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的克隆 (1)根據(jù)NCBI發(fā)表的lba基因序列(V00453J01299)、lbc1-cDNA基因序列(V00452J01300)、lbc2-cDNA基因序列(V00452J01301)、1)、Flbr-cDNA基因序列($70187)的序列分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物,(2)PCR反應(yīng)體系：根據(jù)以上lba、lbc1， lbc2、Flbr的cDNA序列所設(shè)計(jì)的特異 性引物(合成引物加適量的ddH20溶解， 使其終濃度為1

5、0umolL)以Soybean 總eDNA為模板，利用常規(guī)PCR技術(shù)分 別擴(kuò)增出Iba-cDNA、Ibc1-cDNA、 Ibc2-cDNA 、Flbr-cDNA的基因片段。,(3)PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性5min，一個(gè) 循環(huán)；94變性1min，62 (1ba,lbc1, lbc2)、退火3.0s，72延伸lmin；30 個(gè) 循環(huán)；72延伸10min，PCR產(chǎn)物4保 存 備用。 (4)PCR產(chǎn)物的鑒定：用1的瓊脂糖凝膠 電泳 鑒定DNA的大小。如果大小正確, 則將PCR產(chǎn)物純化后連接到通用載體 pEGMEasyTVector(Promega) (以下簡(jiǎn)稱(chēng)Tvector)上，再送測(cè)序公司檢 測(cè)P

6、CR產(chǎn)物堿基序列的正確性。,(5)PCR產(chǎn)物的純化：DNA膠回收(TakaraAgaroseGelDNAPurificationkit)：電泳結(jié)束后， 切下含目的片段的瓊脂糖凝膠塊，放入15ml離心管中， 加入3倍體積BindingBuffer，5水浴10min直至徹底 融化；將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到柱中，室溫放置2min， 8000 rmin離心l min，棄收集管中的廢液；取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的廢液，將柱子放入同一個(gè)收集管中，加入500ulWashSolution，8000rmin離心1min；重復(fù)清洗二次(重復(fù)步驟5)后將UNIQ-10柱子放入一新的15ml的離心管中，在柱子

7、膜中央加30uLElutionBuffer(PH7)，室溫放置2 min 12000rmin離心1 min，離心管中液體即為回收的DNA片段，可立即使用或20冷藏備用。,載體的構(gòu)建,質(zhì)粒DNA的制備(堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA) 收集培養(yǎng)過(guò)夜至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌液，用STE緩沖液洗去培養(yǎng)基；菌體懸浮于預(yù)冷的溶液I，激烈振蕩，使細(xì)胞完全分散：冰浴，加入新鮮配制的溶液lI，快速顛倒離心管幾次，使內(nèi)容物充分混勻；冰浴，加入預(yù)冷的溶液III顛倒離心管溫和振蕩，使內(nèi)容物混勻，冰??；離心，吸取上清移至另一離心管中，加入Tris飽和酚j振蕩混勻；離心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，、用氯仿異戊醇處理12次；向

8、最后吸取的上層水相中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕振蕩混合，于室溫中放置沉淀DNA。離心棄上清，加入70乙醇洗滌沉淀；離心去凈上清液；把沉淀干燥后的沉淀溶于TERNA酶緩沖液中，55水浴，冷卻到室溫后20保存?zhèn)溆谩?以T-lba的DNA為模板擴(kuò)增lba 基因,構(gòu)建質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)體系 在20ul反應(yīng)體系中，加入經(jīng)過(guò)BamHl和SacI雙酶切載體DNA(pET-32a)，和經(jīng)過(guò)BamHI和SacI雙酶切得目的片段(1ba的酶切產(chǎn)物)用雙蒸水補(bǔ)足體積，14-16保溫1216小時(shí)，即可轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。用雙蒸水補(bǔ)足體積，14-16保溫1216小時(shí)，即可轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞.,25大腸桿菌感受

9、態(tài)細(xì)胞的制備,從37倒置培養(yǎng)過(guò)夜的平板上挑取單菌落，接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中，37過(guò)夜培養(yǎng)；再將細(xì)菌以1的比例接種到100mlLB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)35小時(shí)二次活化至OD600為10左右；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一次性使用的冰預(yù)冷的50ml的doff管中，在冰上放置10min，使培養(yǎng)物迅速冷卻到0，4 下4100rpm離心10min，棄上清；用2ml冰預(yù)冷的CaCl2(0.1 M)懸浮細(xì)胞，于4 下4100rpm離心10min重復(fù)兩次；用2ml冰預(yù)冷的CaCl2(0.1M)重懸沉淀，每管取200ul分裝于預(yù)冷的15ml離心管中，4保存，可用一周,大腸桿菌的轉(zhuǎn)化,取制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放置于冰上；在

10、感受態(tài)細(xì)胞中加入5ul連接產(chǎn)物或1ul質(zhì)粒，輕彈混勻，冰浴30min；42(熱激溫度很重要)水浴90s，不要搖動(dòng)管；快速冰浴1-2min；每管加800ulLB培養(yǎng)基(37預(yù)熱)，37搖床搖動(dòng)溫浴45min。將100ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂至37預(yù)熱的含相應(yīng)抗生素的LB平板上。將平板放置于超凈臺(tái)中吹至液體被吸收；倒置平板，37下培養(yǎng)12-16h可出現(xiàn)菌落，4保存,克隆載體的鑒定,取適量克隆載體(或連接產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分別過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，在適當(dāng)濃度的含有EB的瓊脂糖凝膠中電泳，參考對(duì)照質(zhì)粒載體或DNAMarker的分子量作初步的判斷，選擇大小正確的克隆進(jìn)一步用限制性?xún)?nèi)切酶分析和PCR及測(cè)序

11、分析,目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白抗體的制備,IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá) 將構(gòu)建好的質(zhì)粒pET-32a-Iba轉(zhuǎn)入宿主BL21中，挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行劃平板保存并液氮凍存?zhèn)溆?。挑取轉(zhuǎn)化了正確表達(dá)的pET-32a-lba的BL21菌單克隆，在含有Ampr抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。當(dāng)OD600達(dá)到0.6左右時(shí)即可以1的接種量接入新鮮的含有Ampr抗生素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行二活。當(dāng)OD600達(dá)到0.4時(shí)，即可加入終濃度為1mmolL的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，30下225rpm振蕩培養(yǎng)，分別在0h、05h、1 h、2h、4h和6h取出誘導(dǎo)的菌液在4下保存，待下一步處理。將上述收集的菌液在4下800

12、0rpm離心5min，收集菌體。用tris-Cl(50mM，pH=7.4)清洗細(xì)胞兩次，每次在4下12000rpm離心10min，棄上清；最后用1xBindingbuffer重懸菌體，以10s超聲、20S間隔的頻率冰浴超聲30次，等菌液變得澄清之后，在4下12000rpm離心10min，上清液為可溶性的蛋白，沉淀為不可溶性的蛋白，分別準(zhǔn)備進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。,目的蛋白的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測(cè),首先根據(jù)BIO-RAD的說(shuō)明書(shū)安裝玻璃板和電泳儀。配制SDS-PAGE膠，配方見(jiàn)表2-6。進(jìn)行SDS-PAGE電泳：每孔加入約1肛l蛋白樣品，再最后的孔中加入10ul小蛋白mak

13、er。剛開(kāi)始電泳時(shí)在濃縮膠中的電壓為60v，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠中時(shí)電壓調(diào)到80v，溴酚藍(lán)電泳到離膠底處即停止電泳。取出蛋白膠，并用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后鑒定lba蛋白的大小。,衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建,通過(guò)對(duì)cg40質(zhì)粒的rbcL基因和aadA基因做誘變PCR(圖21) (引物為lba-5-leftprimer和lba-3一rightprimer)，將存在于3psbD和rbcL3UTR之間的單一多克隆酶切位點(diǎn)(multiplecloningsites簡(jiǎn)稱(chēng)為：MCS)轉(zhuǎn)移到aadA和rbcL3UTR之間，即獲aadA+MCS+rbcL3UTR 串聯(lián)基因，改造后的質(zhì)粒命名為cg40i一i,25

14、1衣藻的純化及培養(yǎng) (1)藻種純化培養(yǎng) 培養(yǎng)基為T(mén)ris-Acetate-Phosphate(TAP)，初始pH=7.2。在TAP培養(yǎng)基中加入質(zhì)量1.5的瓊脂粉，制成固體培養(yǎng)基平板，再將待分離純化的藻液通過(guò)劃線(xiàn)方法接種在平板上，置于培養(yǎng)箱中，25培養(yǎng)，每3-4周繼代一次。從平板上挑取單藻落，接入100ml液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中以(光照強(qiáng)度100uE(m2 s)PAR，溫度25士1)。的光強(qiáng)光照靜置或水平轉(zhuǎn)速為120rpm培養(yǎng)每5天繼代一1次。 (2)萊茵衣藻的擴(kuò)大培養(yǎng)：在1000ml的三角瓶?jī)?nèi)加入400mlTAP培養(yǎng)基接種萊茵衣藻(接種量為l)，搖床培養(yǎng)5-7天左右，轉(zhuǎn)速120rpm，光照強(qiáng)

15、度100umolm-2.s-1，溫度25士1。,用分光光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)基因衣藻849-1ba,cg40、cg40i-i和轉(zhuǎn)基因之前的藻種849的OD750及葉綠素在培養(yǎng)7天內(nèi)的變化情況，制作生長(zhǎng)狀態(tài)及葉綠素含量變化曲線(xiàn)圖,萊茵衣藻849及849-1ba的生長(zhǎng)狀態(tài)比較,圖為萊茵衣藻849，cg40,cg40i-i，及849-1ba的生長(zhǎng)狀態(tài)(A)及葉綠素舍量(B),對(duì)照組(萊菌衣藻849、cg40，cg40i一I,及轉(zhuǎn)基衣藻849lba的生長(zhǎng)和葉綠素含量變化趨勢(shì)基本一致，藻細(xì)胞均在第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4、5天達(dá)到飽和期，之后就趨于平穩(wěn)；對(duì)照組(轉(zhuǎn)基因藻cg40 cg401一I, 與衣藻849)的

16、生長(zhǎng)速度基本一致，OD750都在第四天達(dá)到3.5左右，約等于細(xì)胞數(shù)為7080 x106個(gè)，葉綠素含量達(dá)到33mg/L左右，但轉(zhuǎn)基因藻lba的OD750在第四天才達(dá)到2.7左右，約等于細(xì)胞數(shù)為6.07.0 x106個(gè)，低于對(duì)照組20左右；葉綠素含量約為27mgL左右低于對(duì)照組18左右。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，Iba基因的轉(zhuǎn)入在一定程度上會(huì)影響衣藻的生長(zhǎng)。,轉(zhuǎn)基因衣藻849-lba與萊茵衣藻849的耗氧及產(chǎn)氫量比較,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了轉(zhuǎn)lba基因藻849-lba與未轉(zhuǎn)lba基因的衣藻849在密閉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)產(chǎn)氫和耗氧量情況，每天定時(shí)監(jiān)測(cè)，一共檢測(cè)了8天。從圖3-19中看出，在正常TAP中培養(yǎng)中，衣藻849-lba和

17、849的產(chǎn)氫量在培養(yǎng)的前4天基本一樣，而且是隨時(shí)間逐漸增加到50-60ul左右；衣藻849在第5天到第8天的產(chǎn)氫量仍然維持在60ul左右，而衣藻849-lba的產(chǎn)氫量在第5天迅速升高到90ul，其最高產(chǎn)氫量比衣藻849高約50(圖319，A)。比較二者的氧氣含量可見(jiàn)培養(yǎng)的前3天，轉(zhuǎn)lba基因比未轉(zhuǎn)基因的衣藻849的氧氣消耗量低了l倍，從第4天開(kāi)始，轉(zhuǎn)lba基因衣藻含氧量仍然一直維持在5左右，比衣藻849的低了4倍(圖319，A)。衣藻849的產(chǎn)氫速率最高只有每小時(shí)0.68ulmgChl，而轉(zhuǎn)lba基因衣藻的產(chǎn)氫速率最高達(dá)到每小時(shí)0.75ulmgChl，明顯比849的產(chǎn)氫速率要高出11.6(圖3

18、19，a)。,因?yàn)榕囵B(yǎng)基中缺硫能提高衣藻的產(chǎn)氫效率，在TAPS培養(yǎng)基下，衣藻849和849-lba的產(chǎn)氫量都是在接種后迅速提高，但轉(zhuǎn)lba基因衣藻的產(chǎn)氫量升高得明顯比衣藻849快，到第6天約為178ul，比衣藻849高29(圖319，B)；此時(shí)轉(zhuǎn)lba基因衣藻的產(chǎn)氫速率為2.25ulmgChlh-1，也比衣藻849的高82(圖3-19，B)。比較二者培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的氧氣含量發(fā)現(xiàn)：從接種開(kāi)始到第3天，轉(zhuǎn)lba基因的衣藻培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的氧氣含量下降速度就比849快，從第1天到第3天衣藻849-lba體系的氧氣含量從22降到3，比衣藻849的大約低約82(圖319，b)。,lba基因的轉(zhuǎn)入對(duì)衣藻耗氧和產(chǎn)氫量的影響,衣藻產(chǎn)氫的最大障礙是氫化酶對(duì)氧氣及其敏感，為了提