1、.,蛋白質(zhì)含量測定 考馬斯亮藍(lán)法,實(shí)驗十一,.,實(shí)驗?zāi)康?掌握考馬斯亮藍(lán)法測定樣品蛋白含量的原理和操作步驟; 進(jìn)一步熟練分光光度計的原理和操作方法; 掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和使用。,.,雙縮脲（NH3CONHCONH3）：凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Folin酚試劑法（Lowry法） Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物），在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。該法的靈敏度是雙縮脲法的100倍. 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法:染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿

2、性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值，與蛋白質(zhì)濃度成正比，靈敏度高比Lowry法約高四倍,.,實(shí)驗原理,1976年由Bradford建立的考馬斯亮藍(lán)法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定方法之一. 考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在游離狀態(tài)下呈棕紅色，在酸性溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變?yōu)樗{(lán)色，使染料最大吸收峰位置，由465nm變?yōu)?95nm。 在595nm測定的吸光度，與蛋白質(zhì)濃度成正比。,.,Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量,.,Bradford 法的突出特點(diǎn): (1)靈敏度高。其最低檢測蛋白質(zhì)含量

3、可達(dá)1mg，這是因為蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的吸光系數(shù)。 (2)測定快速，簡潔，完成一個樣品的測定，只要5分鐘左右 。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘,其顏色在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定（在5-20分鐘之間，穩(wěn)定性最好） (3) 干擾物質(zhì)少。,.,缺點(diǎn): (1) 各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此不同蛋白質(zhì)時有較大的偏差 ； (2)有一些去污劑等物質(zhì)干擾此法的測定； (3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線形，因而不能用比爾定律進(jìn)行計算而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。 此方法靈敏度比紫外吸收法高10-20倍。凱氏定氮法比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以

4、定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì).,.,器材與試劑,可見光分光光度計 試管 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA）配置 考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀釋至1升。,.,(三)操作方法,(1)取6支試管編號，1支作空白，4支加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，1支留作未知樣品。分別加入各種試劑：,.,(2)加完試劑混勻，2-5分鐘后即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值，空白對照為1號管。 用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為橫坐標(biāo)，用吸光值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)，作圖 ，即得一標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的

5、未知樣品吸收值，即可查出樣品蛋白質(zhì)含量。,.,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,坐標(biāo)紙法 電腦軟件法,.,(1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣品的可能的最低與最高值，可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加，并應(yīng)與被測液同樣條件下顯色測定。 (2)標(biāo)準(zhǔn)液的測定：在比色時，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。 (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用的是光密度一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。 用普通方格紙作圖。以橫軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距也應(yīng)占用相同的格數(shù)。,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作-坐標(biāo)紙,.,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長，

6、光密度位置向右延長、交點(diǎn)為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合朗伯比爾定律，則通過原點(diǎn)的直線。 若各點(diǎn)不在一直線，則可通過原點(diǎn)，盡可能使直線通過更多點(diǎn)，使不在直線上的點(diǎn)盡量均勻分布在直線的兩邊。 繪制完畢以后，在座標(biāo)紙上注明實(shí)驗項目的名稱，比色計的型號和儀器編號、單色光波長、日期等。 一般作2-3次以上的平行，重復(fù)性良好曲線方可。 繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測定相同物質(zhì)時使用。當(dāng)更換儀器、移動儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有明顯改變時，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。,.,電腦作圖-Excel為例,首先，將數(shù)據(jù)整理好輸入Excel，并選取完成的數(shù)據(jù)區(qū)，并點(diǎn)擊圖表向?qū)В?點(diǎn)擊圖表向?qū)Ш髸\(yùn)行圖表向?qū)缦聢D，先在圖表類型中選“XY散點(diǎn)圖”，并選了圖表類型的“散點(diǎn)圖” 點(diǎn)擊“下一步”，如果發(fā)現(xiàn)圖不理想，就要仔細(xì)察看是否數(shù)據(jù)區(qū)選擇有問題，如果有誤，可以點(diǎn)擊“系列”來更改.,.,完成了散點(diǎn)圖，現(xiàn)在需要根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計算回歸方程，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。其實(shí)這很簡單，先點(diǎn)擊圖上的標(biāo)準(zhǔn)值點(diǎn)，然后按右鍵，點(diǎn)擊“添加趨勢線”。 點(diǎn)擊趨勢線（也就是我們說的標(biāo)準(zhǔn)曲線）然后按右鍵，選趨勢線格式， 在顯示公式和顯示R平方值（直線相關(guān)系數(shù)）前點(diǎn)一下，勾上。再點(diǎn)確定。公式和相關(guān)系數(shù)都出來了 。,.,.,四.注意事項,（1）如果測定要求很嚴(yán)格，可以