1、人類EGFR基因突變熒光PCR檢測試劑盒說明書【產(chǎn)品名稱】通用名稱：人類EGFR基因突變熒光PCR檢測試劑盒英文名稱：Shuwen Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR【包裝規(guī)格】 7測試 /盒【預(yù)期用途】EGFR是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表達(dá)產(chǎn)物。EGFR 的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路， PLC- 通路，JAK-STAT 通路。通過這些途徑，將胞外信

2、號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號(hào)，從而有效應(yīng)對(duì)外界的信號(hào)刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化，抑制細(xì)胞的凋亡。EGFR異常調(diào)節(jié)通過多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，包括受體的過度表達(dá)、突變、生長因子-受體自分泌環(huán)的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制中最常見的是EGFR的基因突變和過度表達(dá)。EGFR基因位于7號(hào)染色體短臂7pl2-14區(qū)，由28個(gè)外顯子組成。其突變主要發(fā)生在EGFR酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)的編碼區(qū)（第18-20外顯子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（例如吉非替尼、厄洛替尼和?？商婺岬龋┋熜cEGFR基因的突變有密切的相關(guān)性。目前已經(jīng)報(bào)道大約有30種突變與吉非替尼的藥物反應(yīng)相關(guān)，主

3、要是19外顯子上的缺失突變和21外顯子上的L858R的點(diǎn)突變。外顯子19上747-750位氨基酸的大約20種缺失約占所有突變的45%，其中以兩種delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最為常見，占到外顯子19缺失總數(shù)的75%；外顯子21上L858R的點(diǎn)突變占所有突變的45%左右；外顯子18的3種點(diǎn)突變（G719X）約占5%；外顯子20的突變占1%左右。另外研究發(fā)現(xiàn)外顯子20上的T790M突變與酪氨酸激酶抑制劑藥物的耐藥性相關(guān)。本試劑盒以腫瘤DNA為檢測樣本，提供EGFR基因突變的定性檢測。本試劑盒僅為臨床醫(yī)生腫瘤靶向治療藥物的選擇提供參考，具體臨床

4、應(yīng)用時(shí)須結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行判斷，不能以本試劑盒檢測結(jié)果作為臨床診斷的唯一依據(jù)。【檢測原理】本試劑盒結(jié)合特異性引物和TaqMan探針技術(shù)，用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測DNA樣品中的EGFR突變基因。利用特異性引物對(duì)突變靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)阻滯野生型的擴(kuò)增，通過TaqMan探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，使得突變基因得到擴(kuò)增而野生型基本不擴(kuò)增，從而達(dá)到高檢測特異性和高靈敏度。【主要組成成分】本試劑盒具體包含組分如表1表1 編號(hào)組分份數(shù)體積(L)119-Del（1）檢測反應(yīng)液1150219-Del（2）檢測反應(yīng)液11503S768I檢測反應(yīng)液1150420-Ins檢測反應(yīng)液11505T790M檢測反應(yīng)液11506

5、L858R檢測反應(yīng)液11507L861Q檢測反應(yīng)液11508G719X檢測反應(yīng)液1150外控檢測反應(yīng)液1150r-Taq酶130陽性對(duì)照DNA1100無菌超純水1500【儲(chǔ)存條件及有效期】避光，-20以下保存，避免反復(fù)凍融(不要超過5次)，有效期6個(gè)月?！具m用儀器】ABI 7300，ABI 7500，ABI 7900，ABI StepOne，ABI StepOne Plus，Rotor-Gene Q【樣本要求】本試劑盒可以檢測從新鮮組織及FFPE組織中提取的DNA，DNA質(zhì)量及濃度影響檢測的特異性和靈敏度。DNA的質(zhì)量與樣本保存時(shí)間、樣本組成、DNA提取方法密切相關(guān)；而且所采集的臨床樣本中正常

6、組織細(xì)胞的混雜程度也不同，因此對(duì)樣本做如下要求：1、 新鮮標(biāo)本的制備過程中，術(shù)后標(biāo)本取下后應(yīng)立即放入-20以下冰箱中保存；石蠟包埋組織制備過程中，術(shù)后標(biāo)本應(yīng)在1 個(gè)小時(shí)內(nèi)放入10中性緩沖福爾馬林溶液中固定，用量應(yīng)為組織塊的4-20 倍，固定時(shí)間應(yīng)在6-48 小時(shí)之間；2、 新鮮組織樣本，要確保含有腫瘤細(xì)胞大于1%，盡量減少正常組織、間質(zhì)及壞死組織，推薦使用商業(yè)化 試劑盒提取DNA(AXYGEN，QIAGEN等公司產(chǎn)品)。提取的DNA用分光光度計(jì)檢測DNA純度，A260/A280在1.6-2.0之間，如果不能立即檢測請(qǐng)置于-20保存。3、 FFPE組織樣本，要確保含有腫瘤細(xì)胞，盡量去除壞死組織及

7、石蠟邊緣，推薦使用商業(yè)化試劑盒提取DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)。提取的DNA用分光光度計(jì)檢測DNA純度，A260/A280在1.6-2.0之間，如果不能立即檢測請(qǐng)置于-20保存。FFPE組織樣本保存年限尚未超過3年。4、 樣本切片規(guī)格要求為：橫切面面積至少6mm6mm，厚度10m，3片，如果切片面積小請(qǐng)適當(dāng)增加切片數(shù)。最終提取的DNA用100L-200L水溶解，分光光度計(jì)檢測濃度后，稀釋或濃縮成5-10ng/L?！緳z驗(yàn)方法】 本試劑盒可以進(jìn)行5人份的檢測反應(yīng)，并為每個(gè)樣本額外提供一個(gè)參照基因擴(kuò)增反應(yīng)，用于估測樣本實(shí)際DNA的濃度。建議每批次實(shí)驗(yàn)都檢測一個(gè)陽性對(duì)

8、照(positive control)和一個(gè)無模板陰性對(duì)照(NTC)。建議根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分區(qū)操作，如樣品處理區(qū)，反應(yīng)液配制區(qū)等。具體操作步驟如下：1. 將試劑盒中所有組分冰上融化，渦旋混勻并短暫離心，放置于冰上。注意：試劑盒中的所有試管在開蓋前均應(yīng)短暫離心，以免粘在管口或管蓋上的試劑在開蓋時(shí)被污染。2. 每批實(shí)驗(yàn)根據(jù)待檢測樣本數(shù)、一個(gè)陽性對(duì)照、一個(gè)陰性對(duì)照，同時(shí)計(jì)算并分別配制1-8號(hào)反應(yīng)液。每個(gè)反應(yīng)液所需反應(yīng)數(shù) =待測樣本數(shù) + 2（一個(gè)陽性對(duì)照、一個(gè)陰性對(duì)照），而每個(gè)反應(yīng)所需反應(yīng)液19.7L，需r-Taq酶0.3L，即從1-8號(hào)反應(yīng)液中分別?。?9.7反應(yīng)數(shù)）L于對(duì)應(yīng)編號(hào)的1.5EP管，再

9、分別加入（0.3反應(yīng)數(shù)）L的r-Taq酶。注意：由于取樣誤差，請(qǐng)根據(jù)情況適當(dāng)多配置0.3個(gè)反應(yīng)即可。3. 將配制好的混合液輕輕充分混勻，并按照每管20L分裝到每個(gè)PCR反應(yīng)管中。4. 然后向每個(gè)反應(yīng)管中加入5L待檢測DNA、或陽性參照、或水(試劑盒提供)。待檢測樣本最佳濃度范圍為5ng/L-10ng/L，即每個(gè)反應(yīng)管中有效DNA總量為25-50ng。5. 短暫離心消除反應(yīng)管中的氣泡，將PCR反應(yīng)管放入PCR儀。樣本在PCR反應(yīng)板中的布局可參見表2表2 建議布局突變19-del（1）19-del（2）S768I20-InsT790ML858RL861QG719X外控1樣品1樣品1樣品1樣品1樣品

10、1樣品1樣品1樣品1樣品12樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品23樣品3樣品3樣品3樣品3樣品3樣品3樣品3樣品3樣品34樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品45樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品56STDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTD7NTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTC6. 打開操作軟件，設(shè)置PCR擴(kuò)增程序?yàn)镾tage1：95 5minStage2：95 20s，57 32s ，5個(gè)循環(huán)Stage3：95 20s，60 32s ，40個(gè)循環(huán) 收集FAM信號(hào)注：如果使用ABI定量PCR儀，將“Passiv

11、e Reference”設(shè)置為“None”, “reporter”設(shè)置為“FAM”，“quencher”設(shè)置為“TAMRA”【參考值】檢測結(jié)果判定：1. 當(dāng)樣品CT值大于或等于陰性臨界值時(shí)，則該樣品為陰性或低于本試劑盒的檢測下限。2. 當(dāng)樣品CT值小于陰性臨界值時(shí)，則該樣品為陽性。表3 結(jié)果判定19-del(1)19-del(2)S768I20-InsT790ML858RL861QG719X陽性CT28CT28CT30CT28CT28CT28CT29CTS192240-2257 del 18 12370E746_T751I192235-2252AAT del 18 13551E746_T751

12、A192237-2251 del 15 12678E746_S752D192238-2255 del 18 6220L747_A750P192238-2248GC del 1112422L747_T751Q192238-2252GCA del 15 12419L747_E749del192239-2247 del 9 6218L747_T751del192239-2253 del 15 6254L747_S752del192239-2256 del 18 6255L747_A750P192239-2248C del 10 12382L747_P753Q192239-2258CA del 201

13、2387L747_T751S192240-2251 del 12 6210L747_T751del192240-2254 del 15 12369L747_T751P192239-2251C del 1312383E746_T751del192236-2253 del 18 127282號(hào)反應(yīng)體系19-Del（2）E746_S752A192237-2254 del 18 12367E746_S752V192237-2255T del 19 12384S768I202303GT 62413號(hào)反應(yīng)體系S768IH773_V771insH202319-2320 ins CAC 123774號(hào)反應(yīng)體系20-InsD770_N771insG202310-2311