1、第七章 微生物菌種保藏技術(shù),第五節(jié) 微生物菌種的保藏和復(fù)壯 一、菌種的保藏,1低溫保藏法 斜面菌種直接放入04冰箱中保藏，保存時(shí)間不宜過長，一般為 36個(gè)月； 用-20以下的超低溫冰箱或干冰、液氮（-195）凍結(jié)保藏，長達(dá)數(shù)年。 2干燥保藏法 主要是指把菌種接種到適當(dāng)載體上，在干燥條件下進(jìn)行保藏。這種保藏方法主要適合于細(xì)菌的芽胞和霉菌的孢子。細(xì)菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麩皮管保藏。 3隔絕空氣保藏法 用固體石蠟密封試管口以隔絕空氣， 4真空冷凍干燥保藏法 其基本過程是：培養(yǎng)菌種加菌種保護(hù)劑（一般食品工業(yè)用菌種多用牛乳作保護(hù)劑）分裝、預(yù)凍真空凍干真空封口。 5寄主保藏法 用常規(guī)方法保藏的

2、動(dòng)植物病原菌和病毒。,第五節(jié) 微生物菌種的保藏和復(fù)壯 二、菌種的退化與復(fù)壯,（一）常見的菌種退化現(xiàn)象 （二）菌種退化的原因 菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。 （三）防止菌種退化的措施 1控制傳代次數(shù) 2創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 3利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代 4采用有效的菌種保藏方法 （四）退化菌種的復(fù)壯,主要內(nèi)容,菌種保藏的原因,通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時(shí)間內(nèi)不死亡，不會(huì)被其他微生物污染，不會(huì)因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進(jìn)行。 菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其

3、存活而得以延續(xù)。,菌種保藏原理,根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。 低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。,美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心,ATCC是美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 。ATCC的成立可追溯到1925年，一個(gè)科學(xué)委員會(huì)認(rèn)識到科學(xué)研究對于微生物的大量需求而萌發(fā)了創(chuàng)建一個(gè)微生物相關(guān)制品供應(yīng)中心的想法。ATCC以生命科學(xué)領(lǐng)域全方位知識的獲取，分類，匯總，完善進(jìn)而廣泛傳播為己任，以期為推動(dòng)生物原料，生物信息，生物技術(shù)，知

4、識產(chǎn)權(quán)，規(guī)范等相關(guān)領(lǐng)域的前沿性、合法化、實(shí)用性發(fā)揮一定的作用。 ATCC擁有目前世界上最大的、品種最豐富的微生物、細(xì)胞系以及重組DNA原料，同時(shí)它也是科研工作者公認(rèn)的提供世界級的可靠的研究材料的供應(yīng)商。,美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心,美國典型微生物菌種保藏中心, American Type Culture Collection(ATCC) ATCC 主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。 該中心保藏有藻類111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母4

5、6000株，植物組織79株，種子600株，原生動(dòng)物1800株，動(dòng)物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。,中國菌種保藏管理中心,中國菌保會(huì)是國際認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)，下設(shè)7個(gè)全國性菌種保藏管理中心： （1）普通微生物菌種保藏管理中心； （2）農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心； （3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心； （4）醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心； （5）抗生素菌種保藏管理中心； （6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心； （7）林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。（1984 年增加）,中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心,我國唯一的國家級工業(yè)微生物菌

6、種資源保藏管理中心，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)和國際菌種保藏聯(lián)合會(huì)成員之一，隸屬于中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，專業(yè)從事工業(yè)微生物菌種資源保藏管理的公益基礎(chǔ)性資源保藏機(jī)構(gòu)，負(fù)責(zé)全國工業(yè)生產(chǎn)與研究應(yīng)用微生物菌種資源的收集、整理、鑒定、保藏、供應(yīng)與國際交流。 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個(gè)屬251種，近3000株，庫藏備份80000余支 。,中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心,中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 Agricultural Culture Collection of Chin（ACCC） ACCC是中國國家級農(nóng)業(yè)

7、微生物菌種保藏管理專門機(jī)構(gòu),負(fù)責(zé)全國農(nóng)業(yè)微生物菌種的收集、鑒定、評價(jià)、保藏、供應(yīng)及國際交流任務(wù). 庫藏菌種2490株,其中細(xì)菌1004株,放線菌69株,絲狀真菌355株,酵母菌124株,食用菌582.,中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心,中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心成立（英文縮寫：CGMCC，設(shè)立在中國科學(xué)院微生物研究所） 1985年，開始用于專利程序的微生物保存 1995年，獲得布達(dá)佩斯條約國際保藏中心（IDA）的資格 1995年，加入中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì) 宗旨和任務(wù) 。 作為一個(gè)非贏利性、公益性、服務(wù)性技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)，CGMCC的宗旨是廣泛收集國內(nèi)外的微生物資源，妥善保存，以公開的

8、保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù)、科研教育提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料,在保證生物安全和保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的前提下，為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務(wù)，最大限度的實(shí)現(xiàn)微生物資源的保護(hù)、共享和持續(xù)利用。,德國與韓國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心,德國微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有9400種細(xì)菌、2400種真菌、500種酵母菌、300種質(zhì)粒、500種動(dòng)物細(xì)胞、500種植物細(xì)胞、170種動(dòng)物雜腫瘤、600種植物病毒、90種細(xì)菌病毒等（德文，英文）。 韓國國家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏（KACC），保藏有細(xì)菌890種、真菌1581種、酵母菌62種、cDNA 600種（英文）。,法國標(biāo)準(zhǔn)生

9、物保藏中心,法國國家歷史自然博物館Algotheque du實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心 Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National dHistoire Naturelle（ALCP） ALCP隸屬于法國國家歷史自然博物館，主要從事于工業(yè)微生物學(xué)，應(yīng)用微生物學(xué)，微生物系統(tǒng)分類學(xué)，培養(yǎng)和保藏方法等方面的研究，以及藻類等微生物的分離，鑒定，保藏工作。保藏有藻類600種、細(xì)菌200種。該中心保藏的菌種可出售。,各國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心,法國巴斯德研究所LInstitut Pasteur菌物保藏中心 Collection de LInstitu

10、t Pasteur Of Institut Pasteur(CIP) 加拿大國家微生物健康實(shí)驗(yàn)室微生物菌種保藏中心 National Microbiology Laboratory Health Canada Culture Collections（NML-HCCC） 日本生物技術(shù)研究所微生物菌種保藏中心 Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Instituten(MBIC),傳代培養(yǎng)保藏,一、傳代培養(yǎng)保藏,傳代培養(yǎng)的原理,有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時(shí)，會(huì)很快死亡，因此在這種情況下，

11、只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。,傳代培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn),傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點(diǎn)也很明顯，如：菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；反復(fù)傳代時(shí)，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大；雜菌的污染機(jī)會(huì)較多。,傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng),傳代保存時(shí)，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。 一般地，大多數(shù)菌種的保

12、藏溫度以5為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37進(jìn)行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。,二、冷凍保藏原理,適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會(huì)對菌體造成損傷，使其代謝作用停止，可達(dá)到保藏的目的。,常用的冷凍保藏法,液氮保存法,一、適用范圍 液氮溫度在-196以下,用于快速制冷,速凍,機(jī)械安裝等,一般不用于日常生活,此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長

13、期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。 二、保藏方法 a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.21ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。 b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（150170）時(shí)，則不需熔封。,c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?30分鐘后，觀察有無色素進(jìn)入安瓶。 d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1/min的速度冷卻至25左右，也可在2025的冰箱內(nèi)緩慢冷卻3060min。 e、速冷：最后浸入液氮中快速

14、冷卻至196。 這種方法適用范圍廣，而且是目前常用的較理想的，繁而高效。保藏期23年，甚至長達(dá)9年。,低溫冰箱保存法,一、適用范圍 20、50或85 二、保藏方法 低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。,干冰保存法,一、適用范圍 70左右 二、保藏方法 將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。,菌種保藏的共同注意點(diǎn)：,1、嚴(yán)格的無菌操作； 2、用于保存的微生物在生長前必須處于它生長良好的狀態(tài)； 3、保藏過程中要防止退化的發(fā)生

15、（不同的保藏方法，分別有不同的保存時(shí)間。）,注意事項(xiàng),要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞； 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┪⑸飳鋬龅牡挚沽ΓｋS培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異； 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長； 最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）； 可在菌液內(nèi)添加甘油（甘油管冷凍保藏法）等保護(hù)劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護(hù)劑時(shí)更有效。 原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理，但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí)，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。 就動(dòng)物細(xì)胞而言，應(yīng)在20范圍內(nèi)以1/mi

16、n左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多,數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在35范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍； 若進(jìn)行長期保存，則貯藏溫度越低越好； 取用冷凍保存的菌種時(shí)，應(yīng)采取速融措施，即在3540溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。 總之，首先保持原菌優(yōu)良性狀長期穩(wěn)定，同時(shí)考慮方法的通用性、操作的簡便性和設(shè)備的普及性。,三、干燥保藏法,1、沙土管保存 2、冷凍真空保藏,沙土管保存,1、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏，

17、如：芽孢桿菌、放線菌等。 2、方法：將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入無菌的沙土管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。,沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在能夠抽真空的干燥器中，然抽干后將真空干燥器的旋塞關(guān)閉即可。不用火焰封口，用時(shí)將真空干燥器放氣打開取出，剩余的繼續(xù)抽真空，抽至真空后關(guān)閉旋塞保藏即可。 此法簡單易行，并可以將微生物保藏較長時(shí)間，適合一般實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。,冰凍真空保藏,原理是首先將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品先預(yù)冷，使其凍結(jié)，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的

18、生理活動(dòng)就會(huì)停止，因此可以達(dá)到長期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存。,達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動(dòng)處于休眠，可以達(dá)到長期保藏的目的。 用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均不錯(cuò)，而且經(jīng)抽真空封閉的菌種安瓿瓶的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法。,注意事項(xiàng),a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜；菌齡以達(dá)到對數(shù)生長期為好；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好；菌液濃度以高為好，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到1091010/ml。 b、菌株號碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶內(nèi)封入標(biāo)簽。 c、安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈