1、1,生物大分子分離純化及肝酶提取,設計實驗報告展示,2,一、生物大分子的分離與純化技術 二、肝酶提取,3,首先要確認要分離的生物大分子是什么？,核酸？ 蛋白質(zhì)？ 多糖？ 脂類 ？,其次根據(jù)不同生物大分子的特性制定不同的實驗條件,4,生物大分子分離純化的特殊性,生物材料的組成極其復雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。 許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合

2、影響，很難準確估計和判斷。,5,一、生物大分子制備的前期準備,二、分離純化,三、生物大分子的濃縮，干燥和保存,四、生物大分子含量的測定和純化鑒定,6,前期準備,（一）、明確目的和要求 （二）、了解的生物大分子的物學性質(zhì) 1)在水和各種有機溶劑中的溶解性。 2)在不同溫度、pH 值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性 3)固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性。 4)各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù) 5)其他化學性質(zhì)：如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學試劑的穩(wěn)定性。 6)對其他生物分子的特殊親和力。,7,（三

3、）、生物材料的選擇和前處理,從工業(yè)角度考慮 從科研角度考慮 選材時，注意材料的季節(jié)性，動物的生理狀態(tài)，微生物的生長期，選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。 材料選定以后要預處理,8,（四）細胞破碎,1、機械破碎法 高速組織搗碎機 利用高速旋轉(zhuǎn)的葉片產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎。 處理材料量較大時，使用之。 勻漿器 勻漿器用來破碎那些比較柔軟，易于分散的組織細胞?？蒲猩先舨牧咸幚砹可?，可使用勻漿器。 研磨器,9,（四）細胞破碎,2物理破碎方法 反復凍融法 超聲波破碎法 - 超聲波多用于微生物細胞的破碎。 3化學破碎方法：通過化學試劑的作用使細胞膜的透過

4、性改變。 有機溶劑：丙酮，甲苯，丁醇，氯仿等。 表面活性劑：SDS、特里頓（Triton）、氯化十二烷基吡啶、吐溫（Tween）等。,10,（四）細胞破碎,4酶學破碎方法 外加酶制劑 自溶法 通過細胞本身存在的酶的作用使細胞壁自行破裂。,11,（五）細胞器的分離,12,1離心技術,常速離心機； 高速離心機； 超速離心機；,13,2分離細胞器的方法,差速離心法 密度梯度離心 等密度離心,14,（六）生物大分子的提取,影響提取的因素主要有： 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大小； 由固相擴散到液相的難易； 溶劑的pH值和提取時間等。 通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； 堿性物

5、質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； 溫度升高，溶解度加大； 遠離等電點的pH值，溶解度增加。 提取時所選擇的條件應有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。,15, 水溶液提?。旱鞍踪|(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。 有機溶劑提?。阂恍┖椭惤Y合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。,16,（一）粗制品的分離方法,蛋白質(zhì)和酶粗制：鹽析法，等電點沉淀法，有機溶劑分級分離法等。 RNA 和DNA的粗制：濃鹽法、稀堿法、苯酚法等。 特點：簡便，處理量大，既

6、能除去雜質(zhì)又能濃縮樣品。 缺點：分辨率低。,17,（二）精制品的分離純化方法,離心、柱層析法、電泳法等。 特點：規(guī)模小，分辨率高。,18,（三）結晶-物質(zhì)呈晶狀從溶液中析出的過程,生化物質(zhì)形成結晶的條件： 樣品純度 對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，一般要求純度達50%以上才進行結晶。 溶液的飽和度 溶劑的選擇,19,生物大分子分離、純化方法,20,此外，還可根據(jù)以下性質(zhì)選擇合適的分離純化方法：,21,（一）濃縮-從低濃度的溶液中除去水或溶劑使之變?yōu)楦邼舛鹊娜芤旱倪^程。,濃縮的方法： 沉淀法 蒸發(fā)濃縮 吸收濃縮 超濾法,22,（二）干燥-把潮濕的固體、膏狀物、濃縮液及液體中的水或溶劑除盡的過程。,真空干燥

7、 冷凍真空干燥,23,（三）樣品的保存,1干粉保存：04 冰箱中保存即可（樣品置于干燥器中）。 2液態(tài)保存：04 冰箱即可。不能放在0 以下，因為結冰會使大分子構象破壞，使其失活。,24,（一）含量的測定,測定多糖總量菲林試劑法，蒽酮法，旋光法等。 測定蛋白質(zhì)和酶總量凱氏定氮法，F(xiàn)olin-酚法，雙縮脲法，紫外吸收法等。 測定核酸總量定磷法、紫外吸收法。 二苯胺法測DNA，地衣酚法測RNA。,25,（二）純度鑒定,蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定必須采用23種不同的鑒定方法才能確定。 核酸的純度鑒定從測A260/A280光吸收比值可判定樣品的純度。 RNA，A260/A2802以上， DNA，A260/

8、A2801.8左右,若DNA的A260/A2801.8，說明制劑中存在RNA,需要考慮用RNA酶處理樣品，提高DNA純度。,26,肝酶分離純化與鑒定,設計從動物肝組織中分離、提取、純化、和鑒定一種酶（該酶由不同的亞基組成，為結合酶，pI=6.2）的技術路線，并說明試驗各步驟的原理,27,實驗流程：,1.取動物肝組織 2.制作組織漿液 3.肝酶的粗提取 4.肝酶純化 5.活性檢驗 6.鑒定肝酶純度,28,1.取動物肝組織,材料選擇：選取新鮮的，饑餓24小時的動物的肝臟，生理鹽水多次洗滌，低溫保存。,29,2.制作組織漿液,取新鮮動物肝臟剪碎冰放進培養(yǎng)皿中 移入勻漿器 過濾,30,梯度離心獲得含有

9、酶的細胞液,1：離心管中加入5ml 0.34M蔗糖，將5ml勻漿輕輕覆在 其上，1600r/min離心10min，得上清液（1） 2：沉淀加10ml 0.25M蔗糖混勻，3500r/min離心10min， 得上清液（2） 3： 將上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min離心 10min，得上清液，即為酶體和微粒體,31,3.肝酶的粗提,原 理 中性鹽類能破壞溶液中蛋白分子表面電荷和水化膜，從而使蛋白質(zhì)從溶液中凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白質(zhì)所需鹽類的濃度不同。例如，50飽和的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33飽和的硫酸銨則使-球蛋白沉淀。）因此，可根據(jù)所要分離的蛋白質(zhì)，選擇不同飽

10、和度的硫酸銨溶液進行鹽析。,32,勻漿液+藥品混勻,轉(zhuǎn)移,離心,粗蛋白,33,實驗步驟,配制高濃度的硫酸銨溶液，測溶液PH值并用稀 硫酸或氨水調(diào)PH到6.2 將酶溶液與硫酸銨溶液混合，靜止一段時間 離心，去上清，留沉淀 加蒸餾水溶解，將溶液放入透析袋中透析，得含酶 的溶液,34,4.肝酶的純化,層析： 離子交換層析：定相是具有固定電荷的離子交換劑，動相是具有不同PH值和離子強度的溶液 凝膠層析：又稱凝膠過濾、分子篩層析、凝膠滲透層析等。主要是根據(jù)多孔凝膠對不同大小分子的排阻效應不同而進行分離的。 吸附層析：主要根據(jù)物質(zhì)對活性固體表面吸附親和力的差異來分離。 分配層析：是根據(jù)素質(zhì)在定相中溶解度的

11、差異或在定相和動相中溶解度的差異來進行分離的 親和層析：是根據(jù)生物大分子的生物特異性吸附來進行分離的。,35,離子交換柱層析法實驗原理,混合物在經(jīng)過固定相和流動相的過程中，不斷地 進行交換、分配、吸附及解吸附等過程，由于其中各 組分間在理化性質(zhì)上存在著差異，因此當它們經(jīng)過上 述相同重復過程時，各自的情況就有會所不同，從而 使各物質(zhì)得以分離。 離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素； CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素； DEAE纖維素），當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子 交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì) 被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度 辦法將吸附的蛋

12、白質(zhì)洗脫下來。,36,粗蛋白,純化蛋白,37,實驗步驟,DEAE-纖維素處理為PH值為6.1（Hcl） 裝柱與平衡（乙酸銨溶液） 樣品上樣、乙酸銨溶液洗脫收集，以20%三氯乙酸或磺基水 楊酸溶液檢測蛋白質(zhì)含量為縱坐標，收集管號為橫坐標，收 集第二個峰的蛋白溶液 處理DEAE-纖維素溶液為PH=6.3 裝柱與平衡（乙酸銨溶液） 樣品上樣、用乙酸銨緩沖液洗脫收集，以蛋白質(zhì)含量為縱坐 標，收集管號為橫坐標，收集第一個峰的酶溶液 即為PI=6.2左右的蛋白質(zhì)溶液,38,5.活性檢驗,實驗原理 結合酶的輔助因子按其與酶蛋白結合的緊密程度 不同分為輔基和輔酶，輔基與酶蛋白共價鍵緊密結合， 透析超濾等物理方

13、法不能除掉，輔酶與酶蛋白非共價 結合，較為疏松，透析和超濾等方法可以分離。,39,實驗步驟,若結合酶含有輔基，則直接加入底物，根據(jù)生成物的 性質(zhì)進行生成物的鑒定 若結合酶含有輔酶，則加入輔助因子（小分子有機化 合物和金屬離子）然后再加入底物鑒定 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶的分離純度,40,實驗原理：Acr (丙烯酰胺) + Bis (交聯(lián)劑N) 網(wǎng)狀結構凝膠 引發(fā)劑過硫酸銨（Ap），催化劑四甲基乙二胺（TEMED） SDS(十二烷基磺酸鈉:陰離子表面活性劑）能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水 鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結合成復合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷 的量遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差 異。 SDS-PAGE常用來檢測蛋白質(zhì)樣品的純化程度，如果被 鑒定的蛋白質(zhì)很純，只含有一種三級結構的蛋白質(zhì)或含 有相同分子量亞基的具有四級結構的蛋白質(zhì)，那么SDSPAGE后就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。 不連續(xù)凝膠電泳的支持體由分離膠和濃縮膠組成。上 層為濃縮膠，下層為分離膠，兩層中Acr（丙烯酰胺） 濃度不同，孔徑大小就不同，帶電荷蛋白質(zhì)離子在濃縮 膠中泳動時，因受阻力小，泳動速度較快。當泳動到小 孔徑分離膠時，遇到阻力大，移動速度逐漸減慢，使樣 品濃縮成很窄的區(qū)帶。 分離膠的孔徑有一定大小，對不同相對分子質(zhì)量的蛋 白質(zhì)來說，通