1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,1,學(xué)習(xí)交流PPT,羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測(cè)定腫瘤診斷基因差異表達(dá)研究,主要內(nèi)容,2,學(xué)習(xí)交流PPT,3,學(xué)習(xí)交流PPT,PCR與基因診斷技術(shù),基因診斷即通過核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)直接檢測(cè)基因的存在狀態(tài)或缺陷對(duì)疾病做出診斷的方法。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。1998年，熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測(cè)。,4,學(xué)習(xí)交流PPT,熒光定量PCR技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲

2、線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。熒光染料：SYBRGreenI、EVAGreen，ResoLight熒光探針：TaqMan、HybridizationProbes、MolecularBeacon,5,學(xué)習(xí)交流PPT,羅氏應(yīng)用科學(xué)部整合細(xì)胞組學(xué)和基因組學(xué)的研究流程,6,學(xué)習(xí)交流PPT,LightCyclerReal-TimePCRPlatform超過十年的實(shí)時(shí)熒光PCR的技術(shù)革新,1998,2003,2009,2005/2008,7,學(xué)習(xí)交流PPT,LightCycler480廣泛的應(yīng)用,絕對(duì)定量,相對(duì)定量,基

3、于熔解曲線的基因分型,終點(diǎn)法基因分型,基于HRM的突變掃描,8,學(xué)習(xí)交流PPT,羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床診斷的整體解決方案基因診斷病原體測(cè)定定性分析絕對(duì)定量耐藥性研究腫瘤診斷基因差異表達(dá)研究,主要內(nèi)容,9,學(xué)習(xí)交流PPT,熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用,病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測(cè)性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測(cè)優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目診斷：人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒II型（HSV）、風(fēng)疹病毒其它病原體檢測(cè)：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等,10,學(xué)習(xí)交流PPT,HBVDNA檢測(cè)縮短“窗口期”,有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和

4、早期診斷,11,學(xué)習(xí)交流PPT,熒光定量PCR方法檢測(cè)HBV感染的各期,12,學(xué)習(xí)交流PPT,乙肝的治療,治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類：干擾素：重組人-1b干擾素、-2a、-2b干擾素等核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。,13,學(xué)習(xí)交流PPT,HBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性？,干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對(duì)結(jié)合。病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏。,14,學(xué)習(xí)交流PPT,抗病毒治療中存在的問題逆轉(zhuǎn)錄酶催化中心YMDD變異,YMDD：酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸

5、-天門冬氨酸蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟保↖）或纈氨酸（V）形成YIDD變異株或YVDD變異株,15,學(xué)習(xí)交流PPT,HBV-YMDD變異檢測(cè)的臨床意義,動(dòng)態(tài)檢測(cè)：服用拉米夫定3個(gè)月開始，每月檢測(cè)1次提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個(gè)月檢測(cè)出突變株及時(shí)調(diào)整：適時(shí)調(diào)整用藥方案，防止因耐藥而導(dǎo)致病情惡化,16,學(xué)習(xí)交流PPT,HRM的應(yīng)用介紹用12個(gè)MIRUVNTR位點(diǎn)對(duì)結(jié)核桿菌菌株進(jìn)行基因分型,YuPangetalJournalofMicrobiologicalMethods2011inpress,不同MIRU40位點(diǎn)重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)品的HRM分析結(jié)果.R=repeat,88個(gè)菌株不同MIRU40數(shù)量

6、的Tm值的統(tǒng)計(jì),流行病學(xué)研究,17,學(xué)習(xí)交流PPT,小結(jié),熒光定量PCR可以對(duì)致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測(cè)彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷（如HCV）縮短診斷的窗口期（如HIV），利于早期診斷對(duì)治療過程進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)指導(dǎo)用藥過程及劑量，以制定合理的療效方案結(jié)合臨床表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)的免疫學(xué)、影像學(xué)等診斷方法來綜合評(píng)判，更為科學(xué)。,18,學(xué)習(xí)交流PPT,羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測(cè)定腫瘤診斷突變檢測(cè)個(gè)性化用藥甲基化基因差異表達(dá),主要內(nèi)容,19,學(xué)習(xí)交流PPT,高分辨率熔解曲線定義,高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統(tǒng)的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR儀器與專門

7、的分析算法分辨率高，可以區(qū)分一個(gè)堿基突變的多組核酸樣本，可以區(qū)分野生型（純合子）、突變型（純合子），雜合子使我們可以不必測(cè)序直接篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在遺傳學(xué)變異(SNPs,mutations)與其它方法相比，具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優(yōu)點(diǎn)；而且通量更高，單次成本更低！,20,學(xué)習(xí)交流PPT,HRM的應(yīng)用,SNP位點(diǎn)的檢測(cè)(已知與未知位點(diǎn))單倍型分析，雜合性喪失的篩查,種群中優(yōu)勢(shì)等位基因分析，物種鑒定,DNA遺傳作圖，潛在易感基因的篩選醫(yī)學(xué)應(yīng)用：產(chǎn)前診斷，傳染病與遺傳疾病的監(jiān)控，藥物療效的觀察突變，包括小片段的插入和缺失醫(yī)學(xué)應(yīng)用：腫瘤的快速診斷,治療與預(yù)后評(píng)價(jià)甲基化應(yīng)用醫(yī)學(xué)應(yīng)用：腫

8、瘤的快速診斷,治療與預(yù)后評(píng)價(jià),21,學(xué)習(xí)交流PPT,飽和熒光染料創(chuàng)新的飽和熒光染料能夠識(shí)別單堿基突變,并且不抑制PCR反應(yīng),不飽和雙鏈DNA熒光染料SYBRGreenI純合子和雜合子的熔解曲線基本相同飽和雙鏈DNA熒光染料ResoLight、LCGreen、EvaGreen都為綠色熒光染料，最佳激發(fā)波長范圍440-470nm，發(fā)射熒光波長470-520nm。序列的變化會(huì)導(dǎo)致熔解曲線的顯著變化,純合子,雜合子,22,學(xué)習(xí)交流PPT,創(chuàng)新的HRM染料準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子和雜合子LC480HRMMasterMixResoLightDye,SYBRGreenIvsLightCycler480ResoL

9、ightDye后者提供更高的信號(hào)靈敏度和分辨率,23,學(xué)習(xí)交流PPT,HRM技術(shù)和dHPLC的分辨率比較dHPLCHRM,wt,mut,het,wtwtwtwtwtmutmutmutmutmut,wthet,noseparationofhomozygousvariant,FABEx15J,318bpamplicon,SNPA/G,24,學(xué)習(xí)交流PPT,PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于基因掃描的基因分型,25,學(xué)習(xí)交流PPT,兩種同源雙鏈,兩種異源雙鏈,觀察到的4種雙鏈結(jié)構(gòu),雜合子擴(kuò)增,26,學(xué)習(xí)交流PPT,基因掃描高分辨率熔解分析,案例:LPLH3基因的突變(SNPCT)72樣品，PCR產(chǎn)物大

10、小164bp,27,學(xué)習(xí)交流PPT,LightCycler480HRM應(yīng)用介紹基因掃描顯著降低測(cè)序成本,甘露糖結(jié)合凝集素MBL2基因序列變異分析(384個(gè)樣本,擴(kuò)增子長度219bp):4種最常見的基因型在圖像上被分為4組;少量樣本呈現(xiàn)另外的3種遺傳變異,28,學(xué)習(xí)交流PPT,突變定量分析：CYP2C9目前約有16%的臨床藥物由其負(fù)責(zé)代謝(如華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因),portionTallele50%,1:120%,1:514%,1:710%,1:104%,1:250%,144bpamplicon,SNPC/T,29,學(xué)習(xí)交流PPT,凝血因子VIII的突變檢測(cè),第八因子的單堿基替換導(dǎo)致了50

11、%急性血友病A。由于該基因轉(zhuǎn)錄本長達(dá)9kb，且外顯子較?。?9262bp)，利用dHPLC或者測(cè)序檢測(cè)昂貴耗時(shí)。用HRM可篩選出90%的突變。,DetectionofFactorVIIIGeneMutationsbyHigh-ResolutionMeltingAnalysis.Laurieetal.ClinChem.2007,30,學(xué)習(xí)交流PPT,HRM法檢測(cè)KRAS基因的敏感性結(jié)果,擴(kuò)增片段92bp，突變型質(zhì)粒所占的比例分別為0%、2%、5%、10%、20%、50%、100%的混合質(zhì)粒DNA系列中，HRM分析方法可以明顯的檢測(cè)出只含2%的突變型DNA。,31,學(xué)習(xí)交流PPT,不同的KRAS突

12、變類型在HRM判讀圖譜中顯示出與野生型不同的突變型的曲線,32,學(xué)習(xí)交流PPT,羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測(cè)定腫瘤研究突變檢測(cè)甲基化檢測(cè)基因差異表達(dá)研究,主要內(nèi)容,33,學(xué)習(xí)交流PPT,在一般正常的細(xì)胞中，CpG成分處于非甲基化的狀態(tài)甲基化研究對(duì)于了解基因的調(diào)控模式以及疾病的分子生物學(xué)機(jī)制具有重要意義：發(fā)育、癌腫瘤發(fā)生、基因印跡、X染色體失活及相關(guān)遺傳性疾病在特定條件下，譬如許多發(fā)育相關(guān)基因，在發(fā)育的特殊階段去甲基化表達(dá)腫瘤的DNA甲基化改變表現(xiàn)為總體的甲基化水平降低與啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平升高。抑癌基因與修復(fù)基因的甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默與修復(fù)基因失活;而總體低

13、甲基化使反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、癌基因活化和染色體不穩(wěn)定基于甲基化特定標(biāo)志物的量化情況，對(duì)不同的病人進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)水平分級(jí),DNA甲基化現(xiàn)象和疾病研究,34,學(xué)習(xí)交流PPT,2.PCR擴(kuò)增，脲嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后變?yōu)樾叵汆奏?，使甲基化差別轉(zhuǎn)換為堿基序列差別,T,C,mC,U,1.重硫酸鹽處理已變性的DNA，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)殡遴奏?mC,mC,C,U,3.分析:測(cè)序，甲基化特異性PCR，引物延伸，限制性酶消化，雜交orReal-timePCR!,DNA甲基化研究的常規(guī)流程,35,學(xué)習(xí)交流PPT,HighQualityAssessmentofDNAMethylationinArchivalTissuesfro

14、mColorectalCancerPatientsUsingQuantitativeHigh-ResolutionMeltingAnalysis.Balic,M.etal.(2009),J.Mol.Diagn.11,102-108.,在腫瘤發(fā)生過程中，超甲基化的啟動(dòng)是一個(gè)常見的抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，它也同時(shí)被視為腫瘤發(fā)生的特點(diǎn)之一。適當(dāng)保存的組織是檢測(cè)重要的生物標(biāo)志物的重要來源。在早期癌癥監(jiān)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)分析和治療中，DNA甲基化分析方法是一個(gè)理想的手段。使用HRM分析方法，可以穩(wěn)定地檢測(cè)到1%的甲基化DNA,36,學(xué)習(xí)交流PPT,甲基轉(zhuǎn)移酶MGMT與腫瘤預(yù)見性、個(gè)體化治療,Krypuy,M.etal

15、.Rapidhigh-throughputmethylationanalysisusingtheLightCycler480system.Biochemica1,1113;2008,O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MGMT，是細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的一種酶，可以修復(fù)由各種烷化劑造成的細(xì)胞DNA烷基化損傷細(xì)胞中的MGMT水平?jīng)Q定了細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥程度MGMT的甲基化程度直接反映了其表達(dá)水平,37,學(xué)習(xí)交流PPT,羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測(cè)定腫瘤診斷基因差異表達(dá)研究早期篩查分子指紋,主要內(nèi)容,38,學(xué)習(xí)交流PPT,qPCR圖譜作為腫瘤指紋用于早期篩查,早期篩查腫瘤的惡性生

16、長會(huì)引起血液生化環(huán)境的特征性變化，這些變化將會(huì)影響血細(xì)胞某些基因的表達(dá)。根據(jù)不同腫瘤與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，對(duì)外周血細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行人類全基因的表達(dá)差異分析（生物芯片），篩選出腫瘤相關(guān)表達(dá)差異基因。乳腺癌早期診斷（熒光定量PCR法）：通過對(duì)外周血細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行人類全基因組的表達(dá)差異分析，篩選乳腺癌早期診斷的基因標(biāo)記物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)臨床血液樣本中乳腺癌標(biāo)志物的表達(dá)差異，檢測(cè)結(jié)果可用于乳腺癌的早期篩查和輔助診斷。,39,學(xué)習(xí)交流PPT,qPCR圖譜作為成神經(jīng)細(xì)胞瘤指紋Predictingoutcomesforchildrenwithneuroblastomausingamultig

17、ene-expressionsignature.Vermeulen,J.etal.(2009),LancetOncol.10,663-671.,在最大的成神經(jīng)細(xì)胞瘤庫（n=579）中建立、驗(yàn)證了大量的預(yù)后多基因表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)，只需20ngRNA，使用59種預(yù)后基因和5種內(nèi)參基因。這個(gè)驗(yàn)證結(jié)果構(gòu)成的“指紋信息”可以作為一種獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)機(jī)制，使得在當(dāng)前的治療組中能鑒別出病情可能加重的病人。,40,學(xué)習(xí)交流PPT,多因子疾病治療預(yù)后Amultiplexreal-timePCRmethodfordetectionofGSTM1andGSTT1copynumbers.Timofe

18、eva,M.etal.(2009),ClinicalBiochemistry42,500-509.,對(duì)于致癌物質(zhì)解毒和藥物代謝，谷胱甘肽結(jié)合十分重要。人體中大量的GSTT1和GSTM1發(fā)生缺失。GST基因缺失的多樣性對(duì)于多因子疾病，例如不同類型的癌癥，有潛在的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)見因素。在LightCycler480上使用多重PCR反應(yīng)對(duì)GSTM1和GSTT1進(jìn)行基因分型，內(nèi)參基因?yàn)閍lbumin。所有的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)化比例使用LightCycler480軟件進(jìn)行相對(duì)定量。這種新的半定量基因分型方法具有高靈敏度，是大型分子流行病和臨床研究的理想工具。,41,學(xué)習(xí)交流PPT,EuropeanSpaceAgen

19、cyMission歐洲航天計(jì)劃宇航員的基因表達(dá)在太空旅行前后是否有變化？,GPCRs通過cMAP介導(dǎo)的信號(hào)通路影響免疫學(xué)功能樣本來源：進(jìn)入外太空前后的宇航員血樣UPL通用探針庫讓您更快地從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到開始實(shí)驗(yàn)Roche:1dayOthers:2weeks,42,學(xué)習(xí)交流PPT,外太空環(huán)境對(duì)免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá)的影響,ChangesinexpressionpatternbeforeandaftertriptotheISS(RealTimereadyGPCRpanel),DatakindlydistributedfromDr.Dr.S.Kreth,PDDr.A.Chouker,andProf.Dr.M.Thiel,LMUMunich/Germany;,(ESAProjectIMMUNO),出發(fā)前,返回后1,7,30天分別進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)5位宇航員的基因表達(dá)水平檢測(cè)到顯著差異,UPL通用探針庫讓您更快地從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到開始實(shí)驗(yàn)Roche:1dayOthers:2weeks,Mechanismofaction,43,學(xué)習(xí)交流PPT,RealTimereadyHumanGPCRPanel宇航員在進(jìn)入外太空前后血樣中的基因表達(dá)變化,相對(duì)定量檢測(cè)多個(gè)基因在血液中表達(dá)量的變化：進(jìn)入外太空前(P1