1、基因編輯技術(shù)的概念和原理，什么是基因編輯技術(shù)？基因編輯是指基因組定點修飾的新技術(shù)。利用這種技術(shù)，我們可以準(zhǔn)確地定位基因組中的某個位點，并在該位點切下靶基因片段并插入一個新的基因片段。這一過程不僅模擬了基因的自然突變，還對原始基因組進(jìn)行了修改和編輯，從而真正達(dá)到了“編輯基因”的目的。在基因編輯的研究背景下，傳統(tǒng)的動物育種方法受到種源的限制，需要大量的人力、物力和財力，并且要經(jīng)過漫長的培育過程。此外，不同物種間的雜交非常困難，而且很難在育種成果上取得突破性進(jìn)展。在現(xiàn)代動物分子育種中，分子標(biāo)記技術(shù)可以定位與經(jīng)濟性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，鎖定基因與性狀的對應(yīng)關(guān)系，從而快速、可靠地篩選動物后代。然而，利用分子

2、標(biāo)記技術(shù)輔助篩選，其改良程度仍然受到品種現(xiàn)有基因的限制。因此，利用基因工程技術(shù)改良品種可以突破種源的限制和種間雜交的瓶頸，獲得新品種，因此分子育種更加必要和直接。目前，獲得突變體的常用方法是利用T- DNA或轉(zhuǎn)座子構(gòu)建大規(guī)模隨機插入的突變體庫，但構(gòu)建覆蓋整個基因組的飽和突變體庫需要大量的工作和時間。通過定點突變完全滅活靶基因來研究特定基因的功能是最直接有效的方法。近年來，隨著高特異性、可操作性人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速，靶向基因操作被推向高潮，使靶向基因敲除和敲入變得更加簡單和高效。與基于同源重組和胚胎干細(xì)胞技術(shù)的傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)相比，新的基因編輯技術(shù)保留了定點修

3、飾的特點，能夠以更高的效率、更短的構(gòu)建時間和更低的成本應(yīng)用于更多的物種。基因編輯的原理和現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即通過特定的DNA雙鏈斷裂激活細(xì)胞的自然修復(fù)機制，包括非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR)。根據(jù)基因編輯原理，非同源末端連接(NHEJ)是一個低保真度修復(fù)過程。在斷裂的DNA的修復(fù)和重新連接過程中，會發(fā)生隨機插入或堿基丟失，導(dǎo)致移碼突變，從而使基因失活并實現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。如果存在外源供體基因序列，NHEJ機制會將其連接到雙鏈斷裂的DSB位點，從而實現(xiàn)靶向基因敲入?；蚓庉嬙?，同源重組修復(fù)是一個相對高保真的修復(fù)過程。在存在具有同源臂的重組供體的情況下，供

4、體中的外源靶基因?qū)⑼ㄟ^同源重組過程完全整合到靶位點，而沒有隨機的堿基插入或丟失。如果DSB同時在一個基因的兩側(cè)產(chǎn)生，那么在同源供體存在的情況下，原始基因可以被替換。目前，基因編輯技術(shù)主要有三種，即：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù)；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)技術(shù)；核糖核酸引導(dǎo)的CRISPR- Cas核酸酶技術(shù)。1.ZFN基因組編輯技術(shù)、ZFN技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能是基于鋅指蛋白開發(fā)的，具有獨特的DNA序列識別功能。1986年，Diakun等人首次在真核轉(zhuǎn)錄因子家族的DNA結(jié)合區(qū)發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊，1996年，Kim等人首次將鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶人

5、工連接。2005年，Urnov等人發(fā)現(xiàn)一對由四個鋅指連接的ZFN可以識別24 bp的特定序列，從而揭示了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。ZFN由鋅指蛋白(ZFP)和Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由ZFP組成的DNA識別結(jié)構(gòu)域可以識別特定位點并與之結(jié)合，而由霍啟東組成的切割結(jié)構(gòu)域可以發(fā)揮剪切功能，兩者的結(jié)合可以斷裂靶位點的雙鏈DNA(DSB)。因此，細(xì)胞可以通過同源重組修復(fù)機制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機制修復(fù)DNA。HR修復(fù)可能恢復(fù)或插入靶位點，而NHEJ修復(fù)則容易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都會引起移碼突變，從而達(dá)到基因敲除的目的。ZFN誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可以應(yīng)用于許多物種和基因位點，具有

6、良好的發(fā)展?jié)摿?。然而，目前有三個缺陷制約著這項技術(shù)的推廣。(1)設(shè)計與現(xiàn)有戰(zhàn)略高度契合的ZFN需要大量的工作和時間；(2)ZFN在細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)對細(xì)胞是有毒的；(3)雖然三聯(lián)設(shè)計具有一定的特異性，但仍存在不同程度的偏離目標(biāo)效應(yīng)。2.TALEN基因組編輯技術(shù)。2009年，研究人員在植物病原體黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)了一種轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物。其蛋白質(zhì)核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列具有相對恒定的對應(yīng)性。隨后，TALE對DNA序列的特異性識別被用于替代ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它具有較強的可設(shè)計性，不受上下游序列的影響，比ZFN具有更廣泛的應(yīng)用潛力。TALENs含有兩種TALEN蛋白，每一種都

7、是由TALES陣列和Fok融合而成。一個TALEN靶向正義鏈上的靶位點，另一個靶向反義鏈上的靶位點。然后Fok形成一個二聚體，該二聚體在靶序列中間的間隔區(qū)切割DNA，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂。然后，細(xì)胞開始DNA損傷修復(fù)機制。不同TALEN骨架的最佳間隔長度不同，其長度范圍一般為1220 bp。實驗結(jié)果表明，當(dāng)?shù)谝粋€堿基為T時，TALENs具有更好的結(jié)合效果。目前，TALEN已成功應(yīng)用于酵母、哺乳動物和植物的位點特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢，但仍存在一些問題需要解決，如：的離靶效應(yīng)、TALEN與基因組的特異性結(jié)合與染色體位置和相鄰序列有關(guān)等。3。CRISPR /Cas9基因

8、組編輯技術(shù)。1987年，Ishino等人在大腸桿菌K12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)間隔重復(fù)序列，然后發(fā)現(xiàn)該間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫之間的關(guān)系終于在2007年得到證實。在這個系統(tǒng)中，能夠識別外來基因并僅用一個核糖核酸將其降解的功能蛋白質(zhì)引起了研究人員的興趣。直到2012年，Jinek等人首次使用CRISPR /Cas9作為體外可編輯的短核糖核酸介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，這標(biāo)志著CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的成功出現(xiàn)。3。CRISPR /Cas9基因組編輯技術(shù)，CRISPR /Cas系統(tǒng)由Cas9核酸內(nèi)切酶和sgRNA組成

9、。轉(zhuǎn)錄的sgRNA折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，并與Cas9蛋白形成復(fù)合物，引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識別特定的靶位點，切割PAM序列上游的DNA并導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂。啟動DNA損傷修復(fù)機制。從不同菌株中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng)的CrRNA(或人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列長度不同，PAM序列也可能不同。三種不同技術(shù)的比較，續(xù)表，新基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，基因功能的研究，基因治療，模型動物的構(gòu)建，新品種的轉(zhuǎn)化和培育，1。在基因功能研究中，基因敲除是驗證活體動物基因功能的一個必不可少的邏輯環(huán)節(jié)，但傳統(tǒng)的基因敲除方法需要復(fù)雜的靶向載體構(gòu)建、胚胎干細(xì)胞篩選和嵌合動物模型培育等一系列步驟，其成功率受到諸多因素的

10、限制。1.基因功能的研究，即使對于技術(shù)成熟的實驗室來說，用傳統(tǒng)技術(shù)在老鼠身上敲除一個基因通常也需要一年以上的時間?；蚓庉嫷男录夹g(shù)并非如此?；蚯贸咝А⒖焖?，是研究基因功能的有力工具。1.基因功能研究：ZFN技術(shù)已成功實現(xiàn)了模型生物或經(jīng)濟物種(如大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥、玉米、煙草和人類細(xì)胞系，包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)細(xì)胞或胚胎中內(nèi)源基因的定點突變，其中在果蠅、斑馬魚、大鼠和其他物種中也獲得了穩(wěn)定的基因突變。2009年，許多機構(gòu)(如威斯康星醫(yī)學(xué)院、桑加莫生物科學(xué)公司和西格瑪-奧爾德里奇公司)成功培育出首個目標(biāo)基因敲除2.基因治療傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段導(dǎo)入細(xì)胞以替代缺陷基因，但這

11、種方法難以精確控制，且可能產(chǎn)生很大的毒副作用。基因編輯新技術(shù)可以準(zhǔn)確定位、糾正或去除目標(biāo)位點的基因，達(dá)到基因治療的目的。2.基因療法，貝克曼等人使用TALEN技術(shù)從患者的線粒體中去除患病的DNA。這是TALEN首次應(yīng)用于線粒體基因編輯，這項研究有望用于治療母體線粒體疾病。2.基因治療方面，李等人利用技術(shù)在染色體精確定位方面的優(yōu)勢，通過“切割”和“粘貼”基因?qū)崿F(xiàn)了對實驗小鼠的血友病治療，避免了傳統(tǒng)基因治療帶來的插入突變風(fēng)險，并首次在基因治療的基因組編輯方面取得突破。3.建立以人類疾病為基礎(chǔ)的模型動物和動物模型，對研究這些疾病的發(fā)生和治療具有重要意義?；虼虬屑夹g(shù)是在胚胎干細(xì)胞和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)

12、上發(fā)展起來的。模型構(gòu)建費時費錢，模型動物的選擇受胚胎干細(xì)胞的限制?；蚓庉嬓录夹g(shù)不受胚胎干細(xì)胞的限制，效率高、速度快、定點編輯更準(zhǔn)確，可以在各種細(xì)胞和生物的特定位點進(jìn)行切割和修飾。第一個構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的人Jaenisch和他的同事最近利用CRISPR- Cas系統(tǒng)構(gòu)建了一個具有特定突變的小鼠模型。3。構(gòu)建模型動物，4。改革和培育新品種。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化動植物品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因片段插入受體基因組，轉(zhuǎn)化基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良性狀，獲得人類所需的品種?；蚓庉嫾夹g(shù)可以進(jìn)行定點修飾，實現(xiàn)高效定向。Shukla等人修飾了玉米中的1(肌醇磷酸激酶1 (IPK1)基因，使其對除草劑更具抗性，并且肌醇磷酸

13、在發(fā)育中的種子中的表達(dá)譜如預(yù)期的那樣發(fā)生了變化。Townsend等人瞄準(zhǔn)了煙草中乙酰乳酸合成酶基因的SuR (SuRA和SuRB)位點，培育了對咪唑啉酮除草劑和磺酰脲類除草劑具有抗性的新品種?；蚓庉嫷牟蛔闶且豁椥录夹g(shù)，存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價格昂貴等問題，其非目標(biāo)效應(yīng)限制了其在基因治療和其他應(yīng)用中的發(fā)展。隨著越來越多物種基因組測序的完成，基因功能的研究成為后基因時代的焦點?；蚓庉嫾夹g(shù)不僅可以用正?；虼嫱蛔兓蜻M(jìn)行性狀改良和基因治療，還可以用突變基因代替正?；蜻M(jìn)行基因功能研究。與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯技術(shù)擺脫了對胚胎干細(xì)胞的限制，可以應(yīng)用于更多的物種，定向修飾更精確，效率更高，時間更短，獲得的突變可以通過種系遺傳。其中，CRISPR系統(tǒng)可以同時切割多個靶標(biāo)，并且容易獲得純合突變體?；蚓庉嫾夹g(shù)的前景、與基因組編輯技術(shù)相對應(yīng)的友好位點的選擇