1、2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成 這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時代。,人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部 遺傳信息。,蛋白質(zhì)組：生物個體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究,專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),蛋白質(zhì)分離的原理：,根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。,一、基礎(chǔ)知識,（一） 凝膠色譜法,2.凝膠：,大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。,根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進(jìn)行分離。,1

2、.概念：,（分配色譜法）,3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的具體過程,4.凝膠色譜法的原理,相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢; 相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。 相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。,進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時，如何保證蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性呢？,（二）緩沖溶液,能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響， 維持PH基本不變。,1.作用:,2.緩沖溶液的配制:,通常由12 種緩沖劑溶解于水 中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,3. 在本課題中使用的緩沖液是:磷酸緩沖液,

3、成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉,如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？,（三） 電泳：,1.概念：,帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。,2.原理：,許多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電。 在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,3.類型:,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。,聚丙烯酰胺凝膠電泳,在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯

4、酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）,丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng),蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決 于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。,1.原理：,SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大

5、小。,2. SDS作用機(jī)理:,用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。,二、實(shí)驗(yàn)操作,樣品處理粗分離純化純度鑒定,蛋白質(zhì)提取和分離步驟,血液有哪些成分？,（一）血紅蛋白,每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。,（一）血紅蛋白,二、實(shí)驗(yàn)操作,用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什

6、么？,雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提?。蝗说募t細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。,樣品處理粗分離純化純度鑒定,蛋白質(zhì)提取和分離步驟,（二）操作過程,(1)紅細(xì)胞的洗滌:,洗滌目的:,去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的 分離純化。,洗滌操作：,1、采集血樣。 2、低速短時間離心。 3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。 4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。 5、低速短時間離心。 6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。,1.樣品處理,（二）操作過程,洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白； 離心速度過高、時間過長會使

7、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。,注意：,(2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。,(3)分離血紅蛋白溶液：,離心：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。 試管中溶液層次： 第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）； 第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色）； 第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色)； 第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。 分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。,(4)透 析：

8、,過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。 透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。,2. 粗分離,2.凝膠色譜操作:,（1）凝膠色譜柱的制作：,取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)

9、。,凝膠的選擇： A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。 B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。 凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。,（2）凝膠色譜柱的裝填,凝膠色譜柱的裝填： A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。 B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。 注意： 1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。,（2）凝

10、膠色譜柱的裝填,洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。 注意：,50cm高,（2）凝膠色譜柱的裝填,1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。 2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,（3）樣品加入與洗脫,調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。,樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。,注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功,注意：,（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠