1、.,1,結(jié)核分枝桿菌實驗室檢測方法,.,2,分枝桿菌屬,一類細(xì)長略帶彎曲，有時呈分枝狀的桿菌，本屬細(xì)菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fast bacillus），細(xì)菌體內(nèi)含有分枝菌酸，細(xì)胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關(guān)。 本屬細(xì)菌已經(jīng)被鑒定的有70多種，可分為三大類：結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌； 按生長速度可分為三類，即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型,.,3,結(jié)核分枝桿菌群,結(jié)核分枝桿菌，是人和動物結(jié)核病的病原體，包括人結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支

2、桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti），前三種對人類治病，其中人型結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。 結(jié)核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌,.,4,非典型分枝桿菌,偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜/膿腫、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌等 偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種屬于迅速生長型，雞蛋培養(yǎng)基上3-5天可見菌落 其他非典型分枝桿菌多為緩慢生長型,.,5,麻風(fēng)分枝桿菌,麻風(fēng)分枝桿菌（M.leprae

3、）是麻風(fēng)病的病原體，也是抗酸桿菌，但較結(jié)核分枝桿菌短而粗，兩端尖細(xì)，抗酸染色著色均勻，呈束狀或團(tuán)狀排列，結(jié)核分枝桿菌多散在，偶有聚集。為典型的胞內(nèi)寄生菌，有麻風(fēng)桿菌存在的細(xì)胞胞漿呈泡沫狀，稱麻風(fēng)細(xì)胞。 體外不能培養(yǎng)。,.,6,全球約有1/3的人口已經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌，有2000萬活動性肺結(jié)核患者，每年新發(fā)病例900萬人，每秒鐘有1人感染結(jié)核，每年有300萬人死于結(jié)核病。 隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降 20世紀(jì)80年代后，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化,結(jié)核分

4、枝桿菌,.,7,生物學(xué)形狀,結(jié)核分枝桿菌為細(xì)長略帶彎曲的桿菌，有時可見 分枝狀，無芽孢和鞭毛，因衰老或抗結(jié)核藥物的 作用可出現(xiàn)多形態(tài)，如球狀、串珠狀或絲狀， 大小為14X0.4m。,細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)而不易著色，特別是有 大量分枝菌酸包圍在肽聚糖層的外面，一般 用抗酸染色。萋尼染色呈紅色，背景為藍(lán)色； 熒光染料金胺“O”染色，熒光顯微鏡下為橘黃色,.,8,培養(yǎng)特性,.,9,實驗室檢測方法,萋尼染色+熒光染色 羅氏培養(yǎng)+分枝桿菌快速培養(yǎng),抗原抗體檢測 細(xì)胞因子檢測,熒光定量PCR 芯片雜交,病原學(xué),免疫學(xué),分子生物學(xué),.,10,涂片鏡檢-抗酸染色,抗酸染色是目前為止最快的結(jié)核檢出方法，可用來檢

5、測病情進(jìn)展，為感染控制提供參考依據(jù)，可確證培養(yǎng)物為陽性 萋尼染色法紅色普通顯微鏡（高倍） 熒光染色黃或橘色熒光顯微鏡（低倍）,聯(lián)染法：敏感性高，特異性好，速度快！,.,11,抗酸染色局限性,抗酸染色對分枝桿菌非特異，其他如Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（紅球菌屬）、Legionella micdadei（軍團(tuán)菌）、cryptosporidium（隱孢子蟲）、Isospora（等孢球蟲）等有抗酸菌特點 不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌 不能區(qū)分活菌和死菌 敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000條菌時可檢出，而培養(yǎng)可檢出10-100條菌.,.,12,發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LE

6、D）,熒光顯微鏡成本高、易損壞、耗電量大、光源壽命短、顯微鏡價格昂貴且需要在暗室內(nèi)工作等，熒光染色法一直沒有在結(jié)核病痰涂片診斷中得到廣泛的應(yīng)用。 只需將二極管替換普通光學(xué)顯微鏡的目鏡就相當(dāng)于一臺熒光顯微鏡，組裝的“熒光顯微鏡”結(jié)合金胺O染色在結(jié)核病痰涂片檢查中有一定的應(yīng)用價值。,田斌等，發(fā)光二極管熒光顯微鏡在基層實驗室診斷結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用評價. 實用預(yù)防醫(yī)學(xué)2012年10月第19卷第10期.,.,13,分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù),結(jié)核菌培養(yǎng)仍是目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)尤其是藥敏試驗結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用, 是鑒定是否為活菌的可靠方法 1、傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法 需要46周才能檢測到結(jié)核菌的

7、生長而且陽性率也只有30-40；特異性差各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結(jié)核菌需結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗。,.,14,2、分枝桿菌快速液體培養(yǎng)技術(shù) BD公司推出的BACTECMGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)，鑒定藥敏系統(tǒng)，操作簡便，陽性標(biāo)本檢出時間平均為9d：鑒定、藥敏試驗時間平均為4d：陽性標(biāo)本檢出率比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)提高10左右,.,15,固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)優(yōu)缺點,固體培養(yǎng)：污染少，易于進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，但是培養(yǎng)時間長 液體培養(yǎng)：菌體與培養(yǎng)基充分接觸，生長迅速，但易受到污染,.,16,血清學(xué)試驗,.,17,免疫學(xué)檢測方法,1、結(jié)核菌素試驗 凡感染過結(jié)核桿菌的機體，會產(chǎn)生相應(yīng)的致

8、敏淋巴細(xì)胞，具有對結(jié)核桿菌的識別能力，當(dāng)再次遇到通過皮膚注入的少量的結(jié)核菌素時，致敏 淋巴細(xì)胞受相同抗原再次刺激會在48-72小時內(nèi)，產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)紅腫硬節(jié)即為陽性反應(yīng)。 對活動性結(jié)核的診斷靈敏度高達(dá)77，,.,18,局限性：,假陰性： 小兒結(jié)核、老年人結(jié)核、免疫缺陷或免疫功能低下患者（如合并HIV感染、接受免疫抑制劑治療的患者) 假陽性： 接種過卡介苗的人也會產(chǎn)生陽性反應(yīng),.,19,干擾素釋放試驗,被認(rèn)為是近十年來結(jié)核診斷史上取得的最重要成就，該檢測方法的原理是：結(jié)核感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性的記憶性 細(xì)胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增值，釋放干擾素。 目前市售兩種， QFT

9、-G和T-SPOT.TB，比較兩種方法， T-SPOT.TB更靈敏但QFT-G更特異，但均優(yōu)于結(jié)核菌素試驗，同時也被推薦用于潛伏結(jié)核診斷。,.,20,分子生物學(xué)檢測方法,近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天。研究、應(yīng)用報道較多的結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。,.,21,MDR早期診斷,分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)（協(xié)和醫(yī)院）,菌種鑒定,篩查、鑒別診斷,實時熒光PCR,基因芯片快速檢測平臺,.,22,高 效： 一個樣本可同時檢測結(jié)核分枝桿菌和NTM 快

10、 速： 4周（菌培） 3 小時 靈 敏： 10 個菌/反應(yīng)（TB）；102 個菌/反應(yīng)（NTM）,分枝桿菌核酸檢測,功能：TB快速篩查；TB/NTM鑒別診斷,.,23,高 效： 同時檢測 17 種分枝桿菌（包括TB） 快 速：4周（菌種鑒定） 6 小時 靈 敏： 103 個菌/反應(yīng),檢測范圍：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜-膿腫、草、不產(chǎn)色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。,分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）,.,24,通 量：兩個一線抗結(jié)核藥（MDR） 速 度：8周（藥敏） 6 小時 靈敏度：103 個菌/反應(yīng),基于rpoB（利福平）和katG/inhA（異煙肼）的基因突變，對耐多藥結(jié)核病做出快速診斷。,結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒,.,25,五種結(jié)核檢測方法效果評價,結(jié)核組：1260例,非結(jié)核組：100例,改良羅氏培養(yǎng),熒光PCR,涂片法,MGIT 960快速培養(yǎng),結(jié)果比較,斑點層析法,.,26,敏感性、特異性比較,.,27,羅