1、第四章 基因工程載體,載體 （Vectors） 在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體。 載體是DNA雙鏈分子。 載體DNA分子中是有一段生長擴增的非必需區(qū)，該區(qū)經(jīng)人工改造后可插入外源的DNA，并可轉(zhuǎn)入宿主細胞中，使外源DNA與載體DNA共同擴增。,載體的功能,1. 為外源基因提供轉(zhuǎn)入受體細胞的轉(zhuǎn)移能力； 2. 為外源基因提供在受體細胞中的復制或整合能力； 3. 為外源基因提供在受體細胞中的擴增和表達提供必要的條件能力。,理想載體至少必備的條件, 能在宿主細胞中自主復制 容易進入宿主細胞 容易插入外來核酸片段 容易從宿主細胞中分離純化，便于重組操作 具有合適的篩選標

2、記 具有針對受體細胞的親緣性或親和性 （可轉(zhuǎn)移性）,目前的主要載體,質(zhì)粒（Plasmid） 單鏈DNA噬菌體M13 噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（Cosmid） 動物病毒（virus） 細菌人工染色體(BAC) 酵母人工染色體(YAC),大腸桿菌的質(zhì)粒,獨立于染色體以外的能自主復制、并能被穩(wěn)定遺 傳的一類雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。 存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。 分子量： 1-300 kb。 編碼基因少： 23個中等大小的蛋白質(zhì)。如： 抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的 特性（非必須）。 環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。,質(zhì)粒（plasmid）,質(zhì)粒DNA的空間構(gòu)型, SC構(gòu)型:兩條核苷酸鏈

3、均保持著完整的環(huán)形 結(jié)構(gòu)，DNA呈現(xiàn)超螺旋。 OC構(gòu)型:兩條鏈中只有一條保持著完整的環(huán) 形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)缺口，稱之 為開環(huán)DNA。 L 構(gòu)型: DNA雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線性分 子。, 質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率 分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。,1.1 質(zhì)粒的生物學基本特性,1. 自主復制性 攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori），它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復制。 質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制。,2. 生物不相容性（ Incompatibility ） 有時不同的質(zhì)?？赏瑫r共存在于一個細菌內(nèi)，但 同群質(zhì)粒（不同的，但親緣性高）不能共存于

4、同 一細胞，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。 同群質(zhì)粒含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒。 以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE1、pMB1 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 pSC101、F、RP4 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,質(zhì)粒的生物學基本特性,質(zhì)粒的不相容性分子機制,兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內(nèi)。 兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝

5、數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。,3.可轉(zhuǎn)移性 部分質(zhì)粒含有tra基因，指令宿主細胞產(chǎn)生菌毛，合成細胞表面物質(zhì)，促使宿主細胞與受體細胞接合，導致遺傳物質(zhì)從一細胞轉(zhuǎn)移至另一細胞中。 4.穩(wěn)定性 質(zhì)粒在宿主細胞中保持著一定的拷貝數(shù)。 5.寄生性 質(zhì)粒只能在宿主的細胞內(nèi)復制。 6.可擴增性,質(zhì)粒的生物學基本特性,7. 攜帶特殊的遺傳標記 野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性：重金屬離子、毒性陰離子、有機物 物質(zhì)合成：抗生素、細菌毒素、有機堿等。 這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義。,質(zhì)粒的生物學基本特性

6、,1.2 質(zhì)粒的類型,（1）按轉(zhuǎn)移性分 革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等 非接合型質(zhì)粒 非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom 和mob 基因決定。,1.2 質(zhì)粒的類型,（2）按復制機理分：嚴緊控制型質(zhì)粒，松弛控制型質(zhì)粒。 嚴緊型復制質(zhì)粒（stringent plasmid） 嚴緊型質(zhì)粒的復制受到宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴格控制，復制隨細菌染色體的復制同步進行。 特點：拷貝數(shù)少，只有1

7、 - 3 拷貝（接合型質(zhì)粒分子量大， 一般屬嚴緊型）。 松弛型復制質(zhì)粒（relaxed plasmid） 松弛型質(zhì)粒的復制不受宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴格控制，獨立于細菌細胞而自主復制。 特點：拷貝數(shù)多，通常有幾十乃至幾千份拷貝（非接合型 質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。 作為載體的質(zhì)粒應該是松弛型的,1.3 質(zhì)粒的命名,用小寫字母p代表質(zhì)粒，在p字母后面用兩個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒炇颐Q。后面的數(shù)字是構(gòu)建質(zhì)粒的編號。 如：pUC18和pBR322。, 天然質(zhì)粒的局限性 （1）分子量大，拷貝數(shù)低，單一酶切位點少 （2）篩選標志不理想 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 （1）具有復制起點（OR

8、I） （2）具有抗菌素抗性基因是篩選的標志 理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：用來插入外源DNA片 段，且插入后不影響復制功能。 （4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 （5）易從宿主細胞中分離純化。,1.4質(zhì)粒載體的構(gòu)建,加入合適的選擇標記基因，通常是抗生素基因。 增加或減少合適的酶切位點，便于重組。 縮短長度，切去不必要的片段，增加裝載量。 改變復制子，由嚴緊變?yōu)樗沙谛?，以增加拷貝?shù)。 加裝特殊的基因元件。 目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標記基因 Tcr ColE1 6

9、.5 kb 拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標記基因 Apr,1.4質(zhì)粒載體的構(gòu)建, 人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型 （1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 適合大量增殖克隆基因、或需要表達大量的基因產(chǎn) 物。 （2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 不適合大量擴增DNA用。 但有特殊用途。 （3）溫控的質(zhì)粒載體（runaway plasmid vectors） 這是一類溫度敏感型復制控制質(zhì)粒。 溫度低（低于37 ），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（40 ）時，拷貝數(shù)會很快增加到 1000個以上。,（4） 插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因

10、內(nèi)部。,（5）正選擇的質(zhì)粒載體（Direct selection vectors） 直接選擇轉(zhuǎn)化后的細胞。只有帶有選擇標記基因的轉(zhuǎn) 化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。目前通用的絕大部分 質(zhì)粒載體都是正選擇載體。 （6） 表達型質(zhì)粒載體 主要用來使外源基因表達出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。,測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker 整合質(zhì)粒 裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因的整合。 穿梭質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復制子，便于基因能在兩種不同的受體細胞中復制。 探針質(zhì)粒 篩選克隆或?qū)ふ一蛟?如何閱讀質(zhì)粒圖譜,1.首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）

11、2.再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。（1）Ampr 水解內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）Tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞。（3）Camr 生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失 去毒性。（4）neor（Kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418 （卡那霉素衍生物）失活（5）Hygr 使潮霉素失活。,如何閱讀質(zhì)粒圖譜,3.看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 4.再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說

12、，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。,如何閱讀質(zhì)粒圖譜,5.是否含有表達系統(tǒng)元件，即 啟動子核糖體結(jié)合位點克隆位點轉(zhuǎn)錄終止信號。 這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。, University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于 1978年，在pBR322的基礎上改造而成，如 pUC7、 pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 2.8kb 元件來源 復制起點：pBR322的 ori Ampr 基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克 隆位點。 lacZ基因：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列， 是Lac

13、Z 的氨基端片斷。在lacZ 基因中有一段人工合成的含多 種內(nèi)切酶的單一切點，在此位點上插入外源DNA都能 滅活下游lacZ基因。 用于基因克隆和測序,1.5 經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體-pUC系列, 克隆位點：10個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于lacZ 基因的5端。 選擇標記：Ampicillin 抗性和 lacZ 的 肽互補（藍 白斑）相結(jié)合。,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖,異丙基-D-硫代半乳糖苷, 噬菌體（Bacteriophage）噬菌體是一類細菌病毒，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。

14、結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。,2 噬菌體載體,2.1 噬菌體的一般特性,T4 Bacteriophage,2.2.1 溶菌周期 烈性噬菌體（virulent phage) 感染細菌后立即在菌體內(nèi)復制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。 2.2.2 溶原周期 溫和噬菌體（temperate phage) 感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化（lysogenization)。 原噬菌體（prophage)：整合到細菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細菌的染色體復制而復制。,2.

15、2 噬菌體的生活周期（有兩種）,單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、f1、fd 噬菌體。,M13 噬菌體,2.3 單鏈噬菌體載體,2.3.1 單鏈DNA噬菌體的特點 +DNA（ssDNA）。 復制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。 RF DNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生 噬菌斑。 不存在包裝限制。 可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便 于作探針或測序。,2.3.2 M13 噬菌體寄主：大腸桿菌。 DNA長度：6407 bp。 外型: 絲狀組成: 由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成基因: 至少有10個基因DNA提純：RF dsDNA在寄主細胞內(nèi)以高拷貝 形式存在。 成熟

16、的噬菌體里只包裝有 +DNA， 也容易提取。 M13 噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長,RF DNA: replicational form DNA,優(yōu)點：,RF-DNA(復制型DNA) +DNA轉(zhuǎn)譯與包裝相關(guān)的蛋白質(zhì) RFDNA達到200個拷貝時, +DNA被單鏈特異的DNA結(jié)合蛋 白結(jié)合,阻斷-DNA的復制只能以-DNA為模板復制新的+DNA 新的+DNA立即被積累在細胞內(nèi)的殼蛋白包裝成新的噬菌體 顆粒,不斷被擠出宿主細胞,M13 DNA載體的構(gòu)建：,包裝極限可達M13 DNA本身長度的7倍,M13系列載體的優(yōu)點 有MCS，便于克隆不同的酶切片段 Xgal顯色反應，可供直接選擇 無包裝限

17、制，克隆能力大 可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。子代M13噬菌體 中包含的是單連+DNA。,2.4.1 噬菌體的生物學特性： 生物結(jié)構(gòu) 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體 噬菌體由外殼包裝蛋白和-DNA組成 -DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈，稱為cos區(qū)。 -DNA-DNA上至少有61個基因，左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責裂解宿主細胞，DNA自主復制以及調(diào)控基因，中間是負責與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因。,2.4 雙鏈噬菌體載體 載體,DNA進入細菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復制型（RF DNA）。,2.4.3 噬菌體載體的構(gòu)建

18、野生型-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型-DNA的長度，可以提高裝載量。野生型-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。 構(gòu)建原理：刪除噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。 在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點 引進某些突變表型，作為選擇標記 突變某些基因，使它成為安全載體 刪除DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點 噬菌體 DNA上本身有5個 EcoR I 和7 個Hind III切點！ 根據(jù)切除的多少，可將-DNA分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體,插入型載體長度36.4k

19、b 插入片斷長度：0-14.5kb（36.4-51.9kb,替換型-DNA載體長度26kb 插入片斷長度：10.4-24.9kb（36.4-51.9kb,-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分： 一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的。,2.4.5 載體的體外包裝,載體的體

20、外包裝, 體外包裝存在的問題 包裝錯誤：既能包裝內(nèi)源性原DNA，也能包裝重組的 DNA載體。 重組：外源的重組DNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原DNA 發(fā)生重組。 體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75% 105% （3651kb）之間，即既不能超過正常野生型 容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%。 注：野生型DNA的必須區(qū)是28kb，所以載體的最大 克隆容量是23kb。（一般為15kb）。,以噬菌體為載體進行DNA克隆,DNA,用限制性內(nèi)切酶除去中間一段,與外源DNA連接,重組載體的體外包裝,帶有外源DNA的噬菌體,太小不能被包裝,2.4.6-DNA及其重組分子的分離純化,將大腸

21、桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期 加入噬菌體或重組噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時。這時噬菌體顆粒密度已達1013 -1014/L，大腸桿菌細胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放-DNA 乙醇或異丙醇沉淀-DNA,2.4.7-DNA載體的優(yōu)點,-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 -DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量 重組-DNA分子的篩選較為方便 重組-DNA分子的提取較為簡便 -DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，常用于構(gòu)建基因文庫，但不適合表達外源基因,3 cosmid載體（粘粒）,

22、1978年，J. Collins和B. Hohn等人發(fā)展出 cosmid vector（cos site-carrying plasmid) 大?。? - 8kb 組成 DNA：cos序列和控制包裝的序列。 pBR322：質(zhì)粒的復制子 抗藥性基因 幾個限制性酶的單一位點 裝載范圍為31 - 45kb 多用于基因文庫構(gòu)建,cos:cohesive-end site,特點：,考斯質(zhì)粒的構(gòu)建, 由于-DNA包裝蛋白只識別粘性末端的一小段順序cos區(qū)。將這段DNA與質(zhì)粒連在一起，構(gòu)建的重組質(zhì)粒，可裝載外源DNA（45.5kb)，它仍可象-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體，進入細胞后，要通過

23、質(zhì)粒上的復制子進行復制。,cosmid vector的特點,具有噬菌體的特性 在寄主細胞內(nèi)形成環(huán)化DNA 不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌 克隆后可以體外包裝成噬菌體顆粒。 具有質(zhì)粒載體的特性 能象質(zhì)粒一樣復制。 方便的選擇 有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。 高容量的克隆能力 45kb （最少不能低于30kb）。 51kb-5kb=45kb,人類和哺乳動物的基因組很大，甚至許多單個基因也相當大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構(gòu)建的一些載體：BAC，PI，YAC等。,4 人造染色體載體,將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)

24、粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括： 細菌人造染色體（BAC） 酵母人造染色體（YAC）,人造染色體載體,優(yōu)點：能攜帶大片段DNA，約300kb。 在每個細胞中，一個載體分子能繁殖多個拷貝，高產(chǎn)DNA。 缺點：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導致克隆DNA部分的缺失或重排。為克服上述缺點，人們采用低拷貝數(shù)復制子載體，如，E coli中的F因子。此質(zhì)粒含有2種基因（part A, part B）。每個E coli能接受 300kbDNA片段。,細菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,細菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子FF質(zhì)粒的基礎上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間 各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝 pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（gene