1、1,第一節(jié) 島津LC-10AT型HPLC操作規(guī)程,2,目的:規(guī)范島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。 范圍:適用于島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。 職責(zé):質(zhì)檢員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。,3,一、 系統(tǒng)組成,本系統(tǒng)由2個(gè)LC-10ATvp溶劑輸送泵（分主/A泵和副/B泵）、Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、SPD-10Avp紫外-可見檢測(cè)器、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機(jī)、不間斷電源等輔助設(shè)備。,4,二、 準(zhǔn)備,1 、準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相，用合適的0.45m濾膜過(guò)濾，超聲脫氣20min。 2 、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定量環(huán)。 3、

2、配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制），用合適的0.45m濾膜過(guò)濾。（注意腐蝕性與有機(jī)系的的溶劑） 4 、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。,5,接通電源，依次開啟不間斷電源、B泵、A 泵、檢測(cè)器，待泵和檢測(cè)器自檢結(jié)束后，打開打印機(jī)、電腦顯示器、主機(jī)，最后打開色譜工作站。,三、 開機(jī),6,四、 參數(shù)設(shè)定,1、 波長(zhǎng)設(shè)定：在檢測(cè)器顯示初始屏幕時(shí)，按func鍵，用數(shù)字鍵輸入所需波長(zhǎng)值，按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出到初始屏幕。 2 、流速設(shè)定：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按func鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速（柱在線時(shí)流速一般不超過(guò)1ml/min），按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退

3、出。 3 、流動(dòng)相比例設(shè)定：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按conc鍵，用數(shù)字鍵輸入流動(dòng)相B的濃度百分?jǐn)?shù)，按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出。,7,四、 參數(shù)設(shè)定,4、 梯度設(shè)定：4.1 ：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按edit鍵，Enter鍵；4.2 ：用數(shù)字鍵輸入時(shí)間，按Enter鍵，重復(fù)按func鍵選擇所需功能（FLOW設(shè)定流速，BCNC設(shè)定流動(dòng)相B的濃度），按Enter鍵，用數(shù)字鍵輸入設(shè)定值，按Enter鍵；4.3： 重復(fù)上一步設(shè)定其它時(shí)間步驟；4.4 ：用數(shù)字鍵輸入停止時(shí)間，重復(fù)按func鍵直至屏幕顯示STOP，按Enter鍵。按CE鍵退出。,8,五、 更換流動(dòng)相并排氣泡,1： 將A/B管路的吸濾器

4、放入裝有準(zhǔn)備好的流動(dòng)相的儲(chǔ)液瓶中； 2 ：逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)A/B泵的排液閥180，打開排液閥； 3 ：按A/B泵的purge鍵，pump指示燈亮，泵大約以9.9ml/min的流速?zèng)_洗，3min（可設(shè)定）后自動(dòng)停止； 4 ：將排液閥順時(shí)針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。 5 ：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。 6 ：如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，設(shè)流速為5ml/min，按pump鍵，沖洗3min后再按pump鍵停泵，重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。,9,六、 平衡系統(tǒng),1、查看基線： 1.1：按N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程打開“在線色譜工作站”軟件， 1.2：輸

5、入實(shí)驗(yàn)信息并設(shè)定各項(xiàng)方法參數(shù)后， 1.3：按下“數(shù)據(jù)收集”頁(yè)的 按鈕。,10,六、 平衡系統(tǒng),2 、等度洗脫方式 2.1 ：按A泵的pump鍵，A、B泵將同時(shí)啟動(dòng)，pump指示燈亮。用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積的流動(dòng)相。 2.2 ：檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。 2.3 ：觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動(dòng)應(yīng)不超過(guò)1MPa。如超過(guò)則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再操作。 2.4 ：觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移0.01mV/min，噪聲為0.001mV時(shí)，可認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài)，可以進(jìn)樣。,11,六、 平衡系統(tǒng),3 、梯度洗脫方式3.1：

6、以檢驗(yàn)方法規(guī)定的梯度初始條件，按2項(xiàng)下方法平衡系統(tǒng)。3.2 ：在進(jìn)樣前運(yùn)行12次空白梯度。方法：按A泵的run鍵，prog.run指示燈亮，梯度程序運(yùn)行；程序停止時(shí)，prog.run指示燈滅。,12,七、 進(jìn)樣,1 、進(jìn)樣前按檢測(cè)器zero鍵調(diào)零，按軟件中 零點(diǎn)校正 按鈕校正基線零點(diǎn)，再按一下 查看基線 按鈕使其彈起。 2 、用試樣溶液清洗注射器，并排除氣泡后抽取適量即可以進(jìn)樣了。 3、含量測(cè)定的對(duì)照溶液和樣品供試溶液每份至少注樣2次 。,13,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計(jì)算,系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：三個(gè)重要指標(biāo) 分離度（加強(qiáng)）：一般應(yīng)1.5。 重復(fù)性：兩次譜圖的峰面積應(yīng)相差不的過(guò)1%。 理論塔板數(shù)：應(yīng)

7、規(guī)定的理論塔板數(shù)目。 拖尾因子：0.95T1.05 保留時(shí)間：對(duì)照與樣品的主成分保留時(shí)間應(yīng)大致一致。 RSD： 3%,14,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計(jì)算,1、內(nèi)標(biāo)法 用含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式算出校正因子（f）： 其中 As和Ar分別為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的峰面積或峰高，ms和mr分別為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的量。,15,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計(jì)算,2、外標(biāo)法： 用含對(duì)照品的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計(jì)算比值（r）：r=mr/Ar（其中 mr和Ar分別為對(duì)照品的量和相應(yīng)的峰面積或峰高。 ） 再根據(jù)供試品溶液的色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算供試品中被測(cè)成分的含量（mi）：mi=

8、rAi（其中 Ai為供試品溶液中被測(cè)成分的峰面積或峰高）。 必要時(shí)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量和標(biāo)示量折算成標(biāo)示量的百分含量，或根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量折算成百分含量。,16,九、 清洗管路及進(jìn)樣口,1、分析完畢后，先關(guān)檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理機(jī)，再用經(jīng)濾過(guò)和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用過(guò)含鹽流動(dòng)相，則先用水，然后用甲醇-水沖洗，沖洗前先按（4.1.14.1.2）操作，再用分析流速?zèng)_洗，各種沖洗劑一般沖洗1530分鐘，特殊情況應(yīng)延長(zhǎng)沖洗時(shí)間。,17,九、 清洗管路及進(jìn)樣口,2、 沖洗完畢后，逐步降低流速至0，關(guān)泵，進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可使用進(jìn)樣閥所附專用沖洗接頭。 3 、

9、關(guān)斷電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動(dòng)相、柱壓，使用小時(shí)數(shù)，儀器完好狀態(tài)等。,18,【特殊情況】：譜流路系統(tǒng)，從泵、進(jìn)樣器、色譜柱、到檢測(cè)器通池，在分析完畢后，均應(yīng)按（5.1）充分沖洗，特別是用過(guò)含鹽流動(dòng)相的，更應(yīng)注意先用水，再用甲醇-水，充分沖洗。,九、 清洗管路及進(jìn)樣口,19,謝謝大家！,20,第二節(jié) 島津LC-10AT型HPLC注意事項(xiàng),21,一、 流動(dòng)相,1、流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純?cè)噭⒏呒兯螂p蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過(guò)濾后使用，過(guò)濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍； 2、水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過(guò)2天），防止長(zhǎng)菌變質(zhì)； 3、使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若

10、所用流動(dòng)相中有含鹽流動(dòng)相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動(dòng)相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動(dòng)相； A、B、C、D四個(gè)儲(chǔ)液器中其中一個(gè)為棕色瓶，用于存放水相流動(dòng)相。,22,二、樣品,1、采用過(guò)濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒； 2、用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤?，盡量用流動(dòng)相制備樣品液； 3、手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的35倍；,23,三、色譜柱,1、 使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類型等； 2、 使用符合要求的流動(dòng)

11、相； 3、 使用保護(hù)柱； 4、 如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。,24,三、 色譜柱,5、 色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存； 6、 不要高壓沖洗柱子； 7、 不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱； 使用過(guò)程中注意輕拿輕放。,25,四、操作過(guò)程,1、 開機(jī)操作： （1）、打開電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開計(jì)算機(jī)，打開Bootp Server（一般啟動(dòng)時(shí)已打開）； （ 2 ）、自上而下打開個(gè)組件電源，Bootp Server里顯示有信號(hào)時(shí)（有六行字符），打開工作站（先打開On line）；

12、 （3）、打開沖洗泵頭的10異丙醇溶液的開關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；,26,四、 操作過(guò)程,（ 4 ）、注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液； （ 5 ）、使用過(guò)程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。,27,四、 操作過(guò)程,2、 先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min 左右開啟D燈或W燈，以延長(zhǎng)燈的使用壽命； 3、 建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；,

13、28,四、 操作過(guò)程,4、 使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡； 5、 溶劑瓶中的沙芯過(guò)濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾頭變臟或長(zhǎng)菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；,29,四、操作過(guò)程,6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過(guò)程中關(guān)閉D燈、W燈； 7、 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測(cè)器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開關(guān)；,30,四、操作過(guò)程,8、 使用者

14、須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)向老師報(bào)告，不要擅自拆卸儀器。未經(jīng)操作培訓(xùn)，不得擅自使用儀器。,31,自己總結(jié)的12條注意事項(xiàng),以下12條注意事項(xiàng)是自己在安裝和使用液相色譜儀中的經(jīng)驗(yàn)得出的，可能存在某些片面性，如有不當(dāng)之處請(qǐng)多提寶貴建議。,32,1、流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾)。 2、流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。,33,3、不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。 4、使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗4

15、0分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。,34,5.長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。 6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑(如甲醇)等清洗進(jìn)樣器。,35,7.C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。 8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的過(guò)濾器管路過(guò)濾器單向閥檢查 并清洗。 清洗方法：以異丙醇作溶劑沖洗；放在異丙醇中間用超聲波清 洗；用10稀硝酸清洗。,。,36,9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。 10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液

16、體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相 的清洗。,37,11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。 12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊清洗，然后插入新的 流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。,38,謝謝大家！,39,第三節(jié) 高效液相色譜中常遇見的問(wèn)題及處理方法,40,一、 保留時(shí)間變化,1.柱溫變化 2.等度與梯度間未能充分平衡 3.緩沖液容量不夠 4.柱污染 5.柱內(nèi)條件變化 6.柱快達(dá)到壽命,1.柱恒溫 2.至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱 3.用25mmol/L的緩沖液 4.每天沖洗柱 5.穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相

17、 6.采用保護(hù)柱,41,二、 保留時(shí)間縮短,1.流速增加 2.樣品超載 3.鍵合相流失 4.流動(dòng)相組成變化 5.溫度增加,1.檢查泵,重新設(shè)定流速 2.降低樣品量 3.流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向 4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀 5.柱恒溫,42,三、 保留時(shí)間延長(zhǎng),1.流速下降 2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化 3.鍵合相流失 4.流動(dòng)相組成變化 5.溫度降低,1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡 2.用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱 3.流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向 4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀 5.柱恒溫,43,四、 出現(xiàn)肩峰或分叉,1.樣品體積過(guò)大 2.樣品溶劑過(guò)強(qiáng) 3

18、.柱塌陷或形成短路通道 4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 5.進(jìn)樣器損壞,1.用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% 2.采用較弱的樣品溶劑 3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品 5.更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子,44,五、 鬼峰,1.進(jìn)樣閥殘余峰 2.樣品中未知物 3.柱未平衡 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) 5.水污染(反相),1.每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗 2.處理樣品 3.重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑 (尤其是離子對(duì)色譜) 4.每天新配,用抗氧化劑 5.通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水,45,六、 基線噪聲,1.氣泡(尖銳峰) 2.污染(隨機(jī)噪聲) 3.檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲 4.電干擾(偶然噪聲) 5.檢測(cè)器中有氣