1、第六章發(fā)酵工藝實例介紹Introduction History of amino acids production:The story of started in 1908 Isolated glutamic acid, delicious tasteScreen for amino-acid-excreting microorganisms:Corynebacterium glutamicum, In 1957.Monosodium glutamate (MSG):A flavor-enhancing compound氨基酸的生產(chǎn)方法：1. 抽提法：最早采用的生產(chǎn)法，用酸水解蛋白質(zhì)，然后從中

2、提取氨基酸。得到的是各種氨基酸的混合物。堿性或酸性氨基酸容易些，胱氨酸，半胱氨酸，酪氨酸仍用此法生產(chǎn)。2. 發(fā)酵法：目前最常用的方法。成本低，原料來源豐富。包括直接發(fā)酵法(利用微生物直接由糧食原料生產(chǎn)氨基酸)和添加前體物質(zhì)發(fā)酵法（以氨基酸中間產(chǎn)物為原料，用微生物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基酸，可避免氨基酸生物合成途徑中的反饋抑制作用）。3. 酶法：用微生物細胞抽提出的酶類來制造氨基酸，若采用固定化酶或固定化菌體，優(yōu)點則更明顯。4. 化學(xué)合成法：蛋氨酸，甘氨酸得到的DL-氨基酸，若需要L-型的，則進行化學(xué)異構(gòu)體的拆分。L-苯丙氨酸（阿斯巴甜）人體八種必需氨基酸：蘇 纈 亮 異亮 色 苯 蛋 賴氨基酸工業(yè)歷史

3、：氨基酸工業(yè)起源于日本，1908年日本人發(fā)現(xiàn)海藻昆布的鮮味來自其汁液所含的谷氨酸。根據(jù)這個發(fā)現(xiàn)，次年味之素公司開始工業(yè)化生產(chǎn)谷氨酸鈉。當時谷氨酸的生產(chǎn)是通過水解面筋或大豆蛋白獲得的。 半個世紀以后，1957年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)某些微生物（如谷氨酸棒桿菌）會產(chǎn)生氨基酸的積累，并采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸獲成功。這項成果被譽為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進入了代謝調(diào)控階段。 谷氨酸是第一種應(yīng)用發(fā)酵法進行工業(yè)化生產(chǎn)的氨基酸，也是目前產(chǎn)量最高的氨基酸。 我國氨基酸工業(yè)雖然起步早（1964），但品種單一，多數(shù)廠家只生產(chǎn)谷氨酸。第一節(jié)味精人的味覺除了原本發(fā)現(xiàn)的酸甜苦咸等四種外，還有第五種基本味覺，

4、即“甘旨味”，俗稱鮮味。以谷氨酸鈉（味精）最具代表性。為什么味精是谷氨酸的鈉鹽？谷氨酸與其他氨基酸共同組成蛋白質(zhì)時，隱藏于蛋白質(zhì)分子中，無法刺激味蕾呈現(xiàn)鮮味。若從蛋白質(zhì)中釋放出來成為游離氨基酸，形成谷氨酸鈉時，會表現(xiàn)出特別的鮮味。一、概述-早期從天然的食物材料中取得 海帶以熱水煮過后，取其湯濃縮即可得到含味精的濃縮液。-中期最早商業(yè)化制造味精的原料是面筋。20kg小麥面粉可生產(chǎn)1kg味精。因為谷氨酸鈉在植物蛋白中含量豐富。-近期糖是生產(chǎn)味精的主要原料。1958年利用微生物生產(chǎn)味精，以葡萄糖，淀粉水解糖經(jīng)味精生產(chǎn)菌代謝合成大量谷氨酸鈉。放味精有學(xué)問：宜放于不明顯呈酸堿性食物中，注意溫度味精的安全

5、性：1995年美國食品藥品管理局公布了一份報告還味精一個清白，結(jié)論是食用味精是安全的，且對人體有三大重要性：1. 生物體內(nèi)氨基酸和碳水化合物的橋梁。2. 人體合成必需氨基酸所需材料。3. 增加人的攝食量，改善營養(yǎng)狀況和身體免疫力。二、谷氨酸的生物合成機理 1. 谷氨酸 （a-氨基戊二酸） O C-OH 第一代鮮味劑H2N- C- H L-谷氨酸單鈉鹽味精 H-C-H H-C-H H-C =O OH L-型2.谷氨酸的生物合成 NH4葡萄糖 中間產(chǎn)物 - 酮戊二酸 谷氨酸 谷氨酸脫氫酶葡萄糖 6-P-葡萄糖 6-P-葡萄糖酸（HMP: Hexosemonophosphate pathway） 3

6、-P-甘油醛 5-P-核糖 丙酮酸 乙酰CoA 草酰乙酸 檸檬酸蘋果酸 異檸檬酸 延胡索酸 琥珀酸 - 酮戊二酸谷氨酸 透過細胞膜 谷氨酸（圖）（1）EMP:丙酮酸，ATP,NADH2（2）HMP:6磷酸果糖 丙酮酸 3磷酸甘油酸 NADPH2:a酮戊二酸還原氨基化必需的供氫體。（3）TCA循環(huán):生成谷氨酸前體物質(zhì)a酮戊二酸。（4）CO2固定反應(yīng):補充草酰乙酸。P255（5）乙醛酸循環(huán):使琥鉑酸、延胡索酸和蘋果酸的量得到補充，維持TCA循環(huán)的正常運轉(zhuǎn)。P256 谷氨酸脫氫酶（6）還原氨基化反應(yīng):a酮戊二酸 谷氨酸問：丙酮酸進入TCA循環(huán)時會形成CO2，在谷氨酸發(fā)酵中，微生物怎樣固定CO2以提高

7、谷氨酸產(chǎn)率的？回補反應(yīng)（附圖）3.谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征P256（1）有蘋果酸酶和丙酮酸羧化酶。（2）a酮戊二酸脫氫酶活性弱，異檸檬酸脫氫酶活性強，異檸檬酸裂解酶活性弱。（3）谷氨酸脫氫酶活性高，經(jīng)呼吸鏈氧化NADPH2的能力弱。（4）菌體本身利用谷氨酸的能力低。4.谷氨酸產(chǎn)生菌P238（全是細菌） 棒桿菌屬 北京棒桿菌 C. pekinenseCorynebacterium 鈍齒棒桿菌 C. crenatum 谷氨酸棒桿菌 C. glutamicum 短桿菌屬 黃色短桿菌 B. flvumBrevibacterium 產(chǎn)氨短桿菌 B. ammoniagenes 小桿菌屬 嗜氨小桿菌 M. a

8、mmoniaphilumMicrobacterium 節(jié)桿菌屬 球形節(jié)桿菌 A. globiformis Arthrobacter共同點：P238 1）革蘭氏陽性。 2）不形成芽孢。 3）沒有鞭毛，不能運動。 4）需要生物素作為生長因子。 5）在通氣條件下產(chǎn)谷氨酸（需氧微生物）。三、谷氨酸發(fā)酵的工藝控制（一）培養(yǎng)基1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烴 （1）淀粉水解糖的制備 （2）糖蜜原料2.氮源：銨鹽、尿素、氨水 C/N100：1521，實際高達100：28 因為：1）用于調(diào)整pH。 2）分解產(chǎn)生的NH3從發(fā)酵液中逸出。 產(chǎn)酸階段： NH4+不足：使a-酮戊二酸蓄積而很少有谷氨酸生成。

9、NH4+過量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。碳氮比對谷氨酸發(fā)酵有很大影響，大約85%的氮源用于合成谷氨酸，15%用于合成菌體。谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多的多，一般100：0.2-2.0，而谷氨酸C/N為100：15-21。3.無機鹽：磷酸鹽、鎂、鉀、鈉、鐵、錳、銅，其中磷酸鹽對發(fā)酵有顯著影響。不足：糖代謝受抑制，菌體生長不足。過多：a.細胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。 b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脫羧生成）縮合生成纈氨酸的前體物a乙醛乳酸，使纈氨酸在發(fā)酵液中蓄積。4. 生長因子：生物素 作用：影響細胞膜通透性和代謝途徑。（1）作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶，

10、參與脂肪酸的生物合成，進而影響磷酯的合成。（2）濃度過大：促進菌體生長，谷氨酸產(chǎn)量低。因為： -酮戊二酸生成量減少。aa.乙醛酸循環(huán)活躍， b.轉(zhuǎn)氨酶活力增強，谷氨酸轉(zhuǎn)變成其它氨基酸。生物素：B族維生素的一種，又稱維生素H或輔酶R。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成： 利用乙酰CoA（直接原料是丙二酸單酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（輔基為生物素）催化下合成。脂肪酸甘油磷酸磷脂蛋白質(zhì) 生物膜因此，脂肪酸是組成細胞膜類脂的必要成分。 生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透過細胞膜分泌至體外。使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速排出的方法1. 用生理學(xué)手段 直接抑制膜合成或使膜受缺損 如: Glu發(fā)酵中，

11、控制生物素亞適量可大量分泌Glu；當培養(yǎng)液中生物素含量較高時采用適量添加青霉素的方法；2. 利用膜缺損突變株 油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。甘油缺陷型菌株的細胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸?？刂萍毎さ臐B透性(1) 通過生理學(xué)手段控制細胞膜滲透性(2) 通過細胞膜缺損突變控制細胞膜滲透性工業(yè)上利用谷氨酸棒狀桿菌大量積累谷氨酸，應(yīng)采用的最好方法是（ ）A加大菌種密度B改變碳源和氮源比例C改變菌體細胞膜

12、通透性D加大葡萄糖釋放量為什么添加適量生物素或青霉素可提高谷氨酸產(chǎn)量？ 生物素：乙酰-CoA羧化酶的輔酶，與脂肪酸及磷脂合成有關(guān)?？刂粕锼睾?，可改變細胞膜的成分，改變膜的透性、谷氨酸的分泌和反饋調(diào)節(jié)。 生物素含量高時，細胞膜致密，阻礙Glu分泌，并引起反饋抑制，加適量青霉素可提高Glu產(chǎn)量。青霉素：抑制肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽酶活性，引起肽聚糖結(jié)構(gòu)中肽橋無法交聯(lián)，造成細胞壁缺損，在膨脹壓的作用下代謝物外滲，降低了谷氨酸的反饋抑制，提高了產(chǎn)量。 （二）pH的影響及其控制 作用機理：主要影響酶的活性和菌的代謝。 在氮源供應(yīng)充分和微酸性條件下，谷氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)向谷氨酰胺發(fā)酵。 pH控制在中性或微堿性。 方

13、法：流加尿素和氨水。（三）溫度的影響及其控制菌體生長達一定程度后開始產(chǎn)生氨基酸，菌體生長最適溫度和氨基酸合成的最適溫度不同。菌體生長階段：30-34產(chǎn)酸階段：34-36（四）溶解氧的控制P258 ，265 大小由通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速決定。 發(fā)酵產(chǎn)酸階段，通風(fēng)量要適量。不足：發(fā)酵液pH值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。-酮戊二酸蓄積。a-酮戊二酸還原氨基化，使a過大：NADPH2通過呼吸鏈被氧化，影響環(huán)境條件引起谷氨酸合成的代謝轉(zhuǎn)換P263-266控制因子產(chǎn)物氧(不足)乳酸或琥珀酸谷氨酸(充足)-酮戊二酸(過量)NH4+(不足)-酮戊二酸谷氨酸(適量)谷氨酰胺(過量) P243生物素谷氨酸 (限量

14、) 乳酸或琥珀酸(充足) P263pH(酸性)N-乙酰-谷氨酰胺谷氨酸(中性或微堿性) P266磷酸鹽(適量)谷氨酸纈氨酸（高濃度） P265四、下游過程（一）谷氨酸的提取方法 1.等電點沉淀法：P283原理：谷氨酸在等電點處溶解度最小。介穩(wěn)區(qū)：過飽和溶液，但過量的溶質(zhì)并不馬上結(jié)晶析出，溶液具有相對穩(wěn)定性。 （1）水解等電點法 （2）低溫等電點法 （3）低溫連續(xù)等電點法2. 不溶性鹽沉淀法（1）鋅鹽法 pH6.3 加酸 pH2.4谷氨酸鋅離子 谷氨酸鋅沉淀 溶液谷氨酸結(jié)晶原理：谷氨酸與鋅離子形成谷氨酸鋅沉淀，加酸溶解，再將pH調(diào)至2.4，析出谷氨酸結(jié)晶。（2）鹽酸鹽法： Glu在濃鹽酸中生成并

15、析出谷氨酸鹽酸鹽。這是用鹽酸水解面筋生產(chǎn)谷氨酸的原理。即HCl10% 時變得難溶。（3）鈣鹽法： 高溫谷氨酸鈣溶解度大，與菌體等不溶性雜質(zhì)分開，降溫，析出谷氨酸鈣沉淀，加NaHCO3 直接得到味精。4. 離子交換法離子交換樹脂由母體（骨架）和活性基團（與溶液中同性離子交換）組成。 用陽離子交換樹脂吸附谷氨酸形成的陽離子，再用熱堿（ 60 4% NaOH ）洗脫，收集相應(yīng)流分，加鹽酸結(jié)晶。 GA+ GA GA- GA= 12 pIa. 谷氨酸是酸性氨基酸，含2個羧基1個氨基，與陰離子交換樹脂要比與陽離子交換樹脂強，但陰離子機械強度差，價格貴，因而用陽離子交換樹脂。理論上講發(fā)酵液上柱的pH值應(yīng)低于

16、3.22，但實際上控制在5.0 6.0之間。P303原因：因Na+、NH4+交換能力谷氨酸，優(yōu)先交換，置換出H+使pH值低于3.2，使谷氨酸成為陽離子，但不能6.0。b. 洗脫與再生一般用NaOH（4%）洗脫。再生用HCl（5-10%）。以上三個方法也可結(jié)合起來用，如等電點鋅鹽法，等電點離子交換法。4.電滲析法P315。膜分離過程，利用的是電位差。二次電滲析法：pH3.2：除去各種鹽類。pH3.2:除去蛋白質(zhì)、殘?zhí)呛蜕氐确请娊赓|(zhì)。（二）味精制造谷氨酸溶于水活性炭脫色加Na2CO3中和谷氨酸單鈉（味精粗品）除鐵過濾活性炭脫色減壓濃縮結(jié)晶離心分離干燥成品1. 中和： 堿 堿過量 谷氨酸 谷氨酸鈉

17、 谷氨酸二鈉（無鮮味）關(guān)鍵：防止谷氨酸二鈉的生成。措施：用碳酸鈉中和時，pH值控制在6.77.0之間。2. 中和液除鐵、鋅原料，設(shè)備，鹽酸，堿鐵 不符合食品標準，F(xiàn)e2+過多，影響色澤。鋅鹽法提取谷氨酸鋅方法：a.沉淀法：Na2S法，使Fe2+，Zn2+ 沉淀除去。 b.離子交換法：陽離子交換樹脂。優(yōu)點：除Fe2+完全，無污染（Na2S法產(chǎn)生硫化氫氣體）。3. 脫色：吸附法活性碳 離子交換法4. 濃縮：除去大量水分，使溶液達到過飽和狀態(tài)，采用減壓濃縮（因為高溫脫水生成焦谷氨酸鈉）。5. 結(jié)晶：將溶液濃縮到介穩(wěn)區(qū)內(nèi)。起晶方法：刺激起晶粉末 晶種起晶結(jié)晶6. 分離：離心機除去粘附在晶體上的水分。7

18、. 干燥：80（120 失去結(jié)晶水）我國味精技術(shù)進展情況制糖工藝進展：酸法水解酶酸法水解雙酶法水解。發(fā)酵工藝進展：亞適量生物素水平（產(chǎn)酸46gdl高生物素水平（產(chǎn)酸1215gdl）。提取工藝進展：等電點法（少數(shù)鋅鹽法）等電離交法低溫連續(xù)等電點法（少數(shù)廠家采用）。精制工藝進展：全粉炭脫色、硫化堿除鐵顆粒炭脫色、樹脂除鐵。第二節(jié)檸檬酸-使用最廣的酸味劑。-廣泛存在于植物果實中（柑桔類及漿果類水果，大都與蘋果酸共存）。-對人體有益，廣泛用于清涼飲料，水果罐頭等。-提取不能滿足需要。-合成法不被人們所接受。-發(fā)酵法生產(chǎn)的有機酸接近自然產(chǎn)物。檸檬酸（citric acid）學(xué)名：2-羥基-丙烷三羧酸或-

19、羥基丙三酸分子式C6H8O7 ，分子量192.13商品檸檬酸有：Anhydrous citric acid 36.6 結(jié)晶析出Monohydrate citric acid 36.6 結(jié)晶析出一、 歷史1784年，瑞典化學(xué)家最早從檸檬汁中提取出檸檬酸。1893年前，主要從柑橘、菠蘿和檸檬等提取。 1893年后，發(fā)現(xiàn)微生物（青霉）可產(chǎn)生檸檬酸。1913年，利用黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸。1917年，美國采用表面培養(yǎng)法生產(chǎn)檸檬酸。1923年，美國建立第一家固體發(fā)酵生產(chǎn)廠家。1951年，美國率先用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸。我國60年代末開始淺盤發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。1968年，上海酵母廠深層發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸投產(chǎn)。1995

20、年，生產(chǎn)廠家過百家，現(xiàn)30多家。二、檸檬酸生產(chǎn)菌 青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）、曲霉（Aspergillus）等。 國內(nèi)外學(xué)者一致認為：黑曲霉（Aspergillus niger）是生產(chǎn)檸檬酸的最佳菌種。因為：黑曲霉具有多種較強的酶系，邊長菌、邊糖化、邊發(fā)酵產(chǎn)酸。檸檬酸發(fā)酵微生物-黑曲霉（A. niger）菌落：黑色頂囊：球形或近球形小梗：雙層，第一層長，布滿頂囊表面，放射狀孢子：球形，黑褐色，有小棘，成鏈排列（1）黑曲霉的形態(tài)特征孢子區(qū)域為黑色，菌落呈絨毛狀。菌絲有隔膜和分支，無色或有色，有足細胞，頂囊生成1層或2層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一串串分生孢子。（2）黑曲霉的生理特

21、征可利用淀粉。最適生長pH值一般為37，產(chǎn)酸最適pH值1.82.5。 生長最適溫度3337C，產(chǎn)酸最適溫度在2837C，溫度過高易形成雜酸。黃曲霉（A. flavus）菌落：黃色頂囊：球形或近球形小梗：雙層，第一層長，布滿頂囊表面，放射狀孢子：球形或梨形，有小棘，成鏈排列 三、檸檬酸發(fā)酵機制及代謝調(diào)控 1. 檸檬酸生物合成途徑 P253 氧化脫羧 乙酰CoA EMP 縮合葡萄糖 丙酮酸 檸檬酸 草酰乙酸HMP CO2固定反應(yīng)（羧化）TCA循環(huán)與檸檬酸的形成（附圖）2.黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的代謝調(diào)控 P253（1）磷酸果糖激酶是EMP途徑第一個調(diào)節(jié)酶，也是決定EMP途徑代謝流量最重要的關(guān)鍵酶。受檸檬

22、酸，ATP抑制，受NH4+，AMP激活，且：NH4+能有效解除前兩者的抑制。（2）-酮戊二酸脫氫酶受高葡萄糖和NH4+的阻遏。 （3）低pH下，烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶受抑制。三高三低: P484-酮戊二酸脫氫酶a高底物濃度：阻遏 高銨離子濃度:激活磷酸果糖激酶，阻遏-酮戊二酸脫氫酶 高通氧強度：存在一條側(cè)系呼吸鏈,正常情況下，不產(chǎn)生ATP。缺氧導(dǎo)致不可逆失活,NADPH2改走標準呼吸鏈，產(chǎn)生ATP。 低磷酸鹽濃度：否則ATP多。低Mn2+濃度：降低菌體中糖代謝轉(zhuǎn)向合成蛋白質(zhì)、核酸的能力，造成NH4+濃度升高。低pH值：有利于檸檬酸積累。問題：1.黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌為什么能大量積累檸檬酸？ 2.什么機制導(dǎo)致檸檬酸積累？四、檸檬酸的生產(chǎn)工藝黑曲霉（Aspergillus niger）利用淀粉質(zhì)原料大量積累檸檬酸。工藝: 固體或液體深層發(fā)酵原料: 薯干粉、廢糖蜜、甘蔗渣等檸檬酸發(fā)酵工藝（附圖）1. 原料預(yù)處理 淀粉的液化、糖蜜的除雜 我國采用薯干粉發(fā)酵工藝只用液化工藝，利用黑曲霉自身能產(chǎn)生糖化酶，完成后續(xù)的糖化工藝。 液化法是我國檸檬酸工藝的特色方法。深層發(fā)酵的幾種方法-利用薯干粉醪液-利用糖蜜-利用淀粉水解糖2.培養(yǎng)基與發(fā)酵條件 提供高濃度的葡萄糖和充足的氧，而