1、液相色譜定性定量方法,1,學(xué)習交流PPT,1 有關(guān)色譜峰的基本概念（一）,峰底(CD):峰的起點與終點之間連接的直線 峰高(h):峰最大值到峰底的距離 峰寬(KL):在峰兩側(cè)拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離 半高峰寬(W1/2):通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點之間的距離 峰面積（A）:峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值 拖尾峰（Tailing peak）:后沿較前沿平緩的不對稱峰 前伸峰（Leading peak）:前沿較后沿平緩的不對稱峰 基線（Baseline):在正常操作條件下，僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線 基線噪聲（N）:由各種因素所引起的基線波動 基線漂移

2、(Baseline drift):基線隨時間定向的緩慢變化,2,學(xué)習交流PPT,1 有關(guān)色譜峰的基本概念（二）,3,學(xué)習交流PPT,2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)（一）,死時間(dead time，t0)不保留組分的保留時間，即流動相（溶劑）通 過色譜柱的時間。 死體積(dead volume，V0)由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定 相所占據(jù)的空間。V0Ft0（F為流速） 保留時間(retention time，tR)從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。 保留體積(retention volume，VR)從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積，又稱洗脫體積。V

3、RFtR。 調(diào)整保留時間(adjusted retention time，tR)扣除死時間后的保留時間。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，tR只決定于組分的性質(zhì)，因此tR（或tR）可用于定性。tRtRt0 調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，VR)扣除死體積后的保留體積VRVRV0或VRFtR,4,學(xué)習交流PPT,2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(二）,柱效能：色譜柱在分離過程中主要有動力學(xué)參數(shù)決定的分離效能。通常用理論板數(shù)或有效板數(shù)表示。 理論板數(shù)： 若應(yīng)用調(diào)整保留時間 tR計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)( n有效或 neff ) 有效板數(shù)：,5,學(xué)

4、習交流PPT,2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(三）,分離度：兩個相鄰色譜峰的分離程度，以兩個組分保留值之差與其平均峰寬之比表示。,6,學(xué)習交流PPT,分離度圖示,7,學(xué)習交流PPT,響應(yīng)值：組分通過檢測器系統(tǒng)產(chǎn)生的信號值。 相對響應(yīng)值：單位量物質(zhì)與單位量參比物質(zhì)的響應(yīng)值之比。,2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(四）,8,學(xué)習交流PPT,校正因子（f）：相對響應(yīng)值的倒數(shù)，它與峰面積的乘積正比于物質(zhì)的量。 定量限（LOQ）：是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準確度和精密度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。,2 通過測量和計算得到的色譜參數(shù)(五）,檢測限（

5、LOD）：系指試樣中的被測物能被檢查的最低量，是鑒別試驗的靈敏度指標。其越低，反應(yīng)的靈敏度越高。,9,學(xué)習交流PPT,3 液相色譜的定性分析,1、與已知物直接對照 2、已知物峰高增加法 3、二極管陣列檢測器的三維圖譜定性 4、與其他儀器聯(lián)用定性,10,學(xué)習交流PPT,4 色譜法定量的依據(jù),在一定的操作條件下，檢測器的響應(yīng)信號（色譜峰的峰面積或峰高）與進入檢測器組分的量成正比。 即：mi = fi Ai 或 mi = fi hi,式中：mi組分的量 fi比例常數(shù) 這就是色譜法定量的依據(jù)。,11,學(xué)習交流PPT,5 峰面積 A 的測量方法（一）,（1）峰高 h 乘半峰寬 w1/2 法 將色譜峰視為

6、等腰三角形，得到的面積為實際面積的0.94倍，故實際面積應(yīng)為：（適合于對稱峰） A 1.065 h w1/2（相對計算可略去前面系數(shù)） （2）峰高乘平均峰寬法 不對稱峰不能作前述近似，可于峰高0.15及0.85處測得峰寬，取其平均值進行計算： A = h (w0.15+w0.85)/2,12,學(xué)習交流PPT,5 峰面積 A 的測量方法（二）,（3）峰高乘保留時間法 難以量度半峰寬的狹窄峰或半峰寬以上重疊的峰可用下式計算： A 1.065h b tR （相對計算可略去1.065和常數(shù)b） （4）剪紙稱重法 對于不對稱或分離不完全的峰，可將峰剪下，以質(zhì)量代其面積，使用較少。,13,學(xué)習交流PPT,

7、（5）自動積分法 將記錄儀與自動積分儀連接，可直接準確、快速地測出峰的面積。 （6）以峰高代替峰面積定量法 當各種實驗條件嚴格保持不變時，一定進樣范圍內(nèi)色譜峰的半峰寬不變，即可用峰高代替峰面積定量，特別對于狹窄的峰，較面積定量法更為準確。,5 峰面積 A 的測量方法（三）,14,學(xué)習交流PPT,6 定量校正因子（一）,檢測器對不同物質(zhì)的響應(yīng)值不同，故相同質(zhì)量的不同物質(zhì)通過檢測器時，產(chǎn)生的峰面積不等，因而不能直接應(yīng)用峰面積計算組分含量。 為此引入“定量校正因子”以校正峰面積，使之能更真實地反映組分含量。 前面已知：mi fi Ai 即：fi mi / Ai,15,學(xué)習交流PPT,6 定量校正因子

8、（二）,fi 稱絕對校正因子，定量分析中常用的是相對校正因子f i，定義為組分的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕對校正因子之比：,mi、ms用質(zhì)量單位時，f w稱相對質(zhì)量校正因子 mi、ms用摩爾為單位時，f M稱相對摩爾校正因子 注意：應(yīng)用中一般地略去“相對”兩字,16,學(xué)習交流PPT,6 質(zhì)量校正因子的測定方法（三）,準確稱取一定量待測組分的純物質(zhì)和標準物質(zhì)的純物質(zhì)混和后，取一定量（在檢測器的線性范圍內(nèi)）在實驗條件下注入色譜儀，出峰后分別測出兩者峰面積，由前式可求得校正因子。,17,學(xué)習交流PPT,7 常用的幾種定量測定方法（一）,（1）歸一法 當試樣中的全部組分都出峰（即都反映在色譜圖上）時，

9、可以從校正后每峰峰面積占全部色譜峰總面積的分數(shù)，求得該組分的質(zhì)量分數(shù)。,18,學(xué)習交流PPT,7 常用的幾種定量測定方法（二）,歸一法的特殊情況 若試樣中各組分的相對校正因子很接近（如同系物中沸點接近的組分），上式則可簡化為：,x i % = 100,當測量參數(shù)為峰高時，也可以用峰高歸一法計算組分含量。（用峰高校正因子，以峰高代峰面積代入前頁算式即可，）,歸一法具有簡便、準確的特點 不足之處在于僅可使用于所有組分都出峰的情況,19,學(xué)習交流PPT,7 常用的幾種定量測定方法（三）,（2）內(nèi)標法 使用條件：試樣中各組分不能全部出峰、各組分含量懸殊、僅需測定其中部分組分,操作步驟：,準確稱取一定量

10、的試樣； 加入一定量的選定標準物（內(nèi)標物）； 混勻后進樣，進行色譜分析； 根據(jù)內(nèi)標物和試樣質(zhì)量以及色譜圖上相應(yīng)的峰面積，計算待測組分的量。,20,學(xué)習交流PPT,7 常用的幾種定量測定方法（四）,內(nèi)標法待測組分含量計算式如下（由前可推得）:,（各符號意義同上） 內(nèi)標法中常以內(nèi)標物為基準，即：f s 1 ，也可用峰高代替峰面積，做法同上。,21,學(xué)習交流PPT,內(nèi)標法注意事項,內(nèi)標物應(yīng)是試樣中不存在的純物質(zhì)； 加入的內(nèi)標物量與試樣中待測組分量相近； 內(nèi)標物的色譜峰應(yīng)位于待測組分色譜峰附近或幾個待測組分色譜峰之間。,7 常用的幾種定量測定方法（五）,22,學(xué)習交流PPT,內(nèi)標法優(yōu)缺點,優(yōu)點：定量準

11、確，對試樣含有不出峰的組分情況下，也不影響測定。 缺點：每次測定都必須準確稱取樣品和內(nèi)標物質(zhì)量，不適于快速分析。,7 常用的幾種定量測定方法（六）,23,學(xué)習交流PPT,內(nèi)標曲線法,若以 Ci % 對 Ai / As作圖，則可得一條通過原點的直線內(nèi)標標準曲線。,為一常數(shù)，上式則可化為：,x i % =,用內(nèi)標法待測組分含量計算式,若固定試樣稱取量，加入內(nèi)標物也恒定，則有：,7 常用的幾種定量測定方法（七）,24,學(xué)習交流PPT,內(nèi)標標準曲線的繪制,將待測組分的純物質(zhì)配成不同濃度的標準溶液（系列）； b. 取固定量的標準溶液和內(nèi)標物，混合后進樣分析，測出 Ai 和 As； c. 用 Ai / A

12、s 對標準溶液濃度作圖，可得一組通過原點的直線（內(nèi)標標準曲線）。,7 常用的幾種定量測定方法（八）,25,學(xué)習交流PPT,樣品測定與組分定量,稱取與繪制標準曲線相同量的試樣和內(nèi)標物，測出其峰面積比，由標準曲線即可查出待測組分的含量。 內(nèi)標標準曲線法應(yīng)用在生產(chǎn)過程控制分析上，不須計算校正因子，對液體樣品也可量取體積，具有簡便快速的特點。,7 常用的幾種定量測定方法（九）,26,學(xué)習交流PPT,（3）外標標準曲線法,a. 取被測組分的純物質(zhì)，配制成一系列不同濃度的標準溶液； b. 分別取一定體積上述溶液注入色譜柱； c. 得到色譜圖后測出峰面積或峰高； d. 繪出峰面積（或峰高）對濃度的關(guān)系曲線（

13、標準曲線）。,標準曲線的繪制,7 常用的幾種定量測定方法（十）,27,學(xué)習交流PPT,外標法 樣品測定（一）,在同樣操作條件下注入同樣量（一般為體積）的待測試樣，從色譜柱上測得峰面積或峰高，在標準曲線上即可查出待測組分的濃度。 外標法也用于生產(chǎn)過程的控制分析，操作簡便，計算簡單，但分析結(jié)果準確性取決于操作條件的穩(wěn)定性和進樣的重現(xiàn)性。,7 常用的幾種定量測定方法（十一）,28,學(xué)習交流PPT,外標法 樣品測定（二）,當試樣中待測組分濃度變化不大時，可不必作標準曲線，而用單點校正法。即配制一個與被測組分含量接近的標準樣，分別取相同量體積進樣，測定標準樣和待測樣的峰面積，按下式計算組分含量: Ci%

14、 = Ai/As Cs%,7 常用的幾種定量測定方法（十二）,29,學(xué)習交流PPT,（4）標準加入法（一）,標準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標法，以欲測組分的純物質(zhì)加入到待測樣品中，分別測定加入前后的峰面積，從而計算欲測組分在樣品中的含量。 a. 可以單點加入，色譜條件完全相同的情況下，按以下公式計算：,7 常用的幾種定量測定方法（十三）,30,學(xué)習交流PPT,標準加入法（二）,b.可以加入一系列濃度，按標準曲線外推法計算出欲測物在樣品中的含量。 優(yōu)點：不需要另外的內(nèi)標物，不必要進樣非常準確；操作簡單；若在前處理過程加入，可補償被測組分在處理過程中的損失。 缺點：色譜條件要求完全一致，否則會帶來

15、分析誤差。,7 常用的幾種定量測定方法（十四）,31,學(xué)習交流PPT,7 常用的幾種定量測定方法（十五）,標準加入法（三） 標準加入法標準曲線繪制 將一系列已知量待測物分別加入到幾等份的樣品中，配制成濃度為(cx+0), (cx+c1), (cx+c2), (cx+c3). 和樣品有相同基體的標準系列溶液(加標，spiking)； 通過儀器分別測量以上系列溶液的響應(yīng)值S0，S1，S2，S3，S4； 以響應(yīng)信號S對濃度c作圖，再將直線外推與濃度軸相交于一點(下圖)，求得樣品中待測物濃度cx。,32,學(xué)習交流PPT,優(yōu)點：基體(matrix)相近，或者說基體干擾相同； 缺點：麻煩，適于小數(shù)量的樣品分析。,33,學(xué)習交流PPT,8 影響定量準確度的因素,1、樣品制備 -衍生化成可氣化的或有紫外吸收或帶熒光的，轉(zhuǎn)化率要高 -溶劑 -樣品回收率 -樣品溶液的貯存 2、進樣技術(shù) -人員手動進樣 -進樣裝置的準確性 3、色譜條件變化柱溫（氣相）