1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗,生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,1,學(xué)習(xí)交流PPT,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗,實驗室規(guī)則 實驗室安全及防護 實驗室常用玻璃儀器 實驗考試,2,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗室規(guī)則,提前5分鐘到實驗室，不能遲到、早退、曠課，每遲到、早退一次扣1分，每曠課一次扣5分。 禁止在實驗室內(nèi)吃食品，如有違反者按遲到處理。 上課必須穿隔離衣，不能穿拖鞋和吊帶背心，否則禁止進入實驗室。 實驗期間手機必須設(shè)置在振動上，上課期間如急需接、打電話請到走廊上處理。 在實驗室內(nèi)要保持安靜，不得嬉鬧、大聲說話。 認真預(yù)習(xí) 認真做實驗 養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣（實驗中、實驗結(jié)束后） 值日生工作,3,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗室

2、安全及防護,預(yù)防火災(zāi) 預(yù)防中毒 外傷,4,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗室常用玻璃儀器,吸量管*(示教) 試管 燒杯 量筒,5,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗考試,實驗課成績,平時表現(xiàn) 實驗測驗 原理 實驗報告 -格式 結(jié)果 操作考試 分析,6,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗報告網(wǎng)上提交,實驗報告采取網(wǎng)上提交的方式，實驗報告提交時間設(shè)定為3天，即本次實驗結(jié)束后第三天晚上12點之前提交，過期無法再提交，本次實驗報告則記為0分。 盡早提交報告，不要等到最后期限，有時系統(tǒng)不穩(wěn)定，可能提交不上去。 直接將報告粘貼在框中，切記不要以附件方式上傳，否則有可能文件打不開，影響成績。 不要相互抄襲，一旦發(fā)現(xiàn)雷同卷則均記為0分。 若過期沒有

3、提交報告，不要將報告發(fā)到老師郵箱，發(fā)也沒用，最終實驗報告成績只記系統(tǒng)導(dǎo)出的成績。,7,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗一,分光光度技術(shù)及蛋白含量測定,8,學(xué)習(xí)交流PPT,理論 掌握分光光度技術(shù)的基本原理 了解分光光度計的基本構(gòu)造 實驗: 利用分光光度技術(shù)進行蛋白質(zhì)含量測定 1.雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量 2.考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量 3.紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量,9,學(xué)習(xí)交流PPT,一、概念 利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù) 。 應(yīng)用：定性、定量 優(yōu)點：靈敏度高 精確度高 操作簡便、快速,分光光度技術(shù)（Spectrophotography）,10,學(xué)習(xí)交流PPT,二、工作原理

4、物質(zhì)對光線有選擇性吸收作用。 每種物質(zhì)都具有其特征性的吸收光譜。 在一定條件下，物質(zhì)對光的吸收程度與該物質(zhì) 的濃度成正比。,分光光度法所使用的光譜范圍： 200nm 10m 200400nm 400760nm 76010m 紫外光區(qū) 可見光區(qū) 紅外光區(qū),11,學(xué)習(xí)交流PPT,如何定性？ 利用吸收光譜曲線鑒定化合物,吸收光譜曲線： 以不同波長的單色光作為入射光，測定某一溶液的吸光度，以波長為橫軸，吸光度為縱軸作圖，得到溶液的吸收光譜曲線。,每種物質(zhì)有其特征性的吸收光譜，故可作為定性分析的依據(jù)。,吸 光 度,12,學(xué)習(xí)交流PPT,1.朗伯（Lambert）定律 一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時，其光強

5、度隨吸收光介質(zhì)的厚度增加呈指數(shù)減少。 I1/I0=e-K1l 2.比爾（Beer）定律 一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時，其光強度隨吸收光介質(zhì)的濃度的增加呈指數(shù)減少。 I1/I0=e-K2C I0 :入射光強度； I :透射光強度；l ：介質(zhì)厚度 C ：介質(zhì)濃度,如何定量？ Lambert-Beer定律*,13,學(xué)習(xí)交流PPT,3.Lambert - Beer定律*,一束單色光通過某溶液時，光波被溶液吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和溶液厚度成正比。 A=CL A：吸光度； C：溶液濃度； L：液層厚度 ：即摩爾吸光系數(shù)，指一定波長時，溶液的濃度為1 mol/L，光程為 1cm時的吸光度值 。 *

6、在波長、溶液和溫度確定的情況下，由物質(zhì)的特性決定的。,14,學(xué)習(xí)交流PPT,4.計算* （1）標(biāo)準(zhǔn)管法（標(biāo)準(zhǔn)比較法） 實際測定過程中，用一已知濃度的測定物按測定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據(jù)前式計算。 A標(biāo)準(zhǔn)=標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)L標(biāo)準(zhǔn) A樣品=樣品C樣品L樣品 A：吸光度； ：摩爾吸光度； C：溶液濃度； L：液層厚度,15,學(xué)習(xí)交流PPT,因標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液中溶質(zhì)為同一物質(zhì)， 樣品= 標(biāo)準(zhǔn) 因盛標(biāo)準(zhǔn)液和測定液的比色杯徑長相同 L樣品=L標(biāo)準(zhǔn) 故上二式可寫成： A標(biāo)準(zhǔn)/A樣品= 標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)L標(biāo)準(zhǔn)/樣品C樣品L樣品 C樣品=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn) C標(biāo)準(zhǔn),16,學(xué)習(xí)交流PPT,（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

7、 配制一系列已知不同濃度的測定物溶液，按測定管同樣方法 處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標(biāo)，吸 光度為縱座標(biāo)，在方格座標(biāo)紙上作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。 獲取樣品的濃度：根據(jù)測得樣品的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上 獲得測定物的濃度。,17,學(xué)習(xí)交流PPT,標(biāo)準(zhǔn)曲線使用注意事項,標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在測定濃度的一半到二倍之間。 吸光度在0.051.0范圍內(nèi)。 所作標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供短期使用。 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測定管測定應(yīng)在同一臺儀器上進行，避免誤差產(chǎn)生。,18,學(xué)習(xí)交流PPT,5應(yīng)用中注意的問題* Lambert-beers law的偏離：該定律只適應(yīng)于一定濃度范圍，A宜在0.051.0之間； 選擇波長：最大吸收波長

8、； a.靈敏；b.避免雜質(zhì)干擾 參比溶液（空白管）：消除背景效應(yīng)，應(yīng)包含除待測溶質(zhì)以外所有的成分。,19,學(xué)習(xí)交流PPT,空白管： 測量過程中，因比色皿本身和溶劑也會產(chǎn)生一定的光吸收，故設(shè)置一個空白管，即其中除了待測溶質(zhì)以外，其它的成分完全相同。 測量時，首先以空白管對準(zhǔn)光路對儀器調(diào)零，既消除比色皿本身對光的吸收，又消除了非待測物對光的吸收，所測值即為待測物造成的光吸收。,20,學(xué)習(xí)交流PPT,分光光度計(spectrophotometer),一基本部件,21,學(xué)習(xí)交流PPT,22,學(xué)習(xí)交流PPT,二 、分光光度計使用步驟（示教） 三、使用時注意事項* 1. 波長選擇。 2. 機器預(yù)熱。 3.

9、 不測量時，應(yīng)使樣品室蓋處于開啟狀態(tài)，否則會使光電管疲勞。 4. 不應(yīng)把成有腐蝕性液體的比色皿放在儀器表面。,23,學(xué)習(xí)交流PPT,5. 比色皿使用注意事項* 由于紫外光不能透過玻璃比色皿，紫外光區(qū)測量時要用石英比色皿。 同組使用的比色皿必須配套（規(guī)格、新舊程度一致）。 比色皿有2光面與2毛面，光學(xué)表面對準(zhǔn)光路，不能有任何污損，否則會引起光吸收的增加。,24,學(xué)習(xí)交流PPT,比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液體約占全部容積的2/3。 腐蝕性溶液不得長期盛放在比色皿中。 每次使用后,應(yīng)立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水沖洗比色皿34次。 * 本次實驗，考馬斯亮藍可使玻璃比色皿著色，酒

10、精浸泡后清洗。,25,學(xué)習(xí)交流PPT,蛋白質(zhì)定量分析實驗,實驗一 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量 （p50） 實驗三 考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量（p52） 實驗四 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量 （p53）,26,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗一 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,【基本原理】 蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)類似，在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合成紫色的化合物（稱雙縮脲反應(yīng)）。 在一定濃度范圍，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用比色法測定蛋白質(zhì)的含量。 含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)才有此反應(yīng)，故氨基酸無此反應(yīng)。 雙縮脲法的靈敏度為1-20mg。,27,學(xué)習(xí)交流PPT,【操作步驟】,（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 1

11、. 取小試管6支，編號按下表操作,2混合后，于37水浴中放置15分鐘，在540nm波長下比色，以 第6管調(diào)零，測得各管的吸光度值。以各管的吸光度值為縱 座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪成曲線。,28,學(xué)習(xí)交流PPT,（二）樣品測定： 取樣品0.1ml，加生理鹽水0.9m1，再加雙縮脲試劑4m1，于37水浴中放置15分鐘，測其吸光度，根據(jù)吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算得出樣品中蛋白質(zhì)的濃度。 注意：,雙縮脲法的靈敏度為1-20mg，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)液時注意濃度。 實驗時， 樣品管可與標(biāo)準(zhǔn)管同時處理,29,學(xué)習(xí)交流PPT,【基本原理】 考馬斯亮蘭G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)可通過范德

12、華力結(jié)合，與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色轉(zhuǎn)變成藍色，最大吸收峰從465nm變成595nm，能過測定595nm處的光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 優(yōu)點：靈敏度高，1-5g；測定速度快；干擾物質(zhì)少。,實驗三 考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量,30,學(xué)習(xí)交流PPT,1取試管3支，編號按下表操作 試 劑（ml） 空白 標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)本 生理鹽水 0.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(50ugml) 0.1 樣 品 0.1 考馬斯亮藍試劑 5.0 5.0 5.0,2.混勻，放置5分鐘，在波長595nm處，以空白管調(diào)“0”，測 定各管的吸光度。,【操作步驟】,31,學(xué)習(xí)交流PPT,3. 計算 A標(biāo)本/A標(biāo)準(zhǔn) 50 （g/ml）

13、= 樣品中蛋白質(zhì)的含量（g/ml） 注意：蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度50 g/ml,32,學(xué)習(xí)交流PPT,實驗四 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量,【基本原理】 由于蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波長范圍內(nèi)，吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，可作定量測定。 靈敏度：50-100g,33,學(xué)習(xí)交流PPT,【操作步驟】,（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 1.取試管6支，編號，按下表操作。 試劑（ml） 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理鹽水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0 混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計，以第6管調(diào)“0” ，在280nm波長下測定各管光密度，以各管的光密度值為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 （二）標(biāo)本測定：取標(biāo)本1.0ml，加入生理鹽水3.0ml，測A280標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出濃度。,34,學(xué)習(xí)交流PPT,頸椎脫臼處死小鼠，剪開腹部，取出肝臟組織，置于平皿中用PBS清洗。 稱取100mg肝組織，剪碎，并轉(zhuǎn)移到勻漿器中。 將