1、Western blot,印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。,1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNADNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。,而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。,埃德溫邁勒薩瑟恩 （Edwin Mellor Southern）,是什么？,DNA重組技術(shù),siRNA

2、的轉(zhuǎn)染技術(shù),表觀遺傳學(xué)（甲基化，miRNA）,凡是涉及蛋白水平檢測(cè)的研究，均可運(yùn)用到western blot技術(shù),能做什么？,為什么要作蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)？ 研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中 蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，在不同的樣品中，如疾病和正常的樣品之間的表達(dá)差異性。,Western Blot基本原理,在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。,Western Blot 基本原理,流程,一、 原理 與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，

3、“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。,E,3.SDS-PAGE電泳,原理：,SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈.當(dāng) SD

4、S 與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來(lái),而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素,Western Blot 的具體步驟,膜,主要試劑,制膠用（1-6）： 1.1.0mol/L TrisHCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸餾水 100ml 溶解后，（用濃鹽酸調(diào)p

5、H至6.8），室溫下保存。 2.1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸餾水 100ml 溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至8.8），室溫下保存。,3.10SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml 如溶解困難，可在50水浴下溶解，室溫保存。 如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10過(guò)硫酸胺（AP） 過(guò)硫酸胺 0.1g 蒸餾水 1ml （現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過(guò)硫酸胺干粉稱好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多裝幾管，使用時(shí)加入蒸餾水水即可，溶解后，4保存，保存時(shí)間為1周）,5四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4C保存。 630%

6、丙稀酰胺： 4C保存。,下層膠 依次加入 去離子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150l 10%AP 150l TEMED 6l5% 上層膠 依次加入 去離子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60l 10%AP 60l TEMED 6l,75X電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存,用時(shí)稀釋5倍，通常取160ml配制成800ml即可。,81

7、0X轉(zhuǎn)膜緩沖液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存,用時(shí)稀釋10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易產(chǎn)生沉淀）,910XTBS緩沖液 Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸餾水至 1000ml （濃鹽酸調(diào)pH至7.6），溶解后室溫保存。 101XTBST緩沖液 10XTBS緩沖液 100ml 蒸餾水 900ml Tween-20 1 ml 因Tween-20比較粘稠，應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即

8、可防止產(chǎn)生氣泡。 溶解后室溫保存。,11封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶)： 1XTBST緩沖液 95-100 ml 脫脂奶粉 5g 溶解后4保存，可于一周內(nèi)使用。,其他試劑 一抗、二抗、顯影液、定影液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑 A 和 B 兩種試劑,Western Blot 的具體步驟,3.SDS-PAGE電泳,凝膠成份： 丙烯酰胺 N,N-亞甲雙丙烯酰胺 SDS 過(guò)硫酸銨 TEMED H2O,儀器：,電泳緩沖液： Tris-甘氨酸溶液,Western Blot 的具體步驟,3.SDS-PAGE電泳,1.制膠,需緊密固定！,Western Blot 的具體步驟,3.SDS-PAGE電泳,2.上樣,

9、每孔上樣量為20-50 g蛋白；根據(jù)目的蛋白的表達(dá)情況的不同而有所變化。,Western Blot 的具體步驟,3.SDS-PAGE電泳,3.電泳,電泳條件： 推薦：濃縮膠 80V 3545min 分離膠 120V 4575min,Western Blot 的具體步驟,3.SDS-PAGE電泳,SDS-PAGE膠的考馬斯亮藍(lán)染色,Western Blot 的具體步驟,4.轉(zhuǎn)膜,原理：,蛋白因結(jié)合SDS而帶電荷，轉(zhuǎn)膜即在電場(chǎng)作用下從膠中轉(zhuǎn)至膜上的過(guò)程。,Western Blot 的具體步驟,4.轉(zhuǎn)膜,半干式轉(zhuǎn)膜速度快，適合與小分子量蛋白,濕式成功率高并特別適合用于分子量大于 100KD的蛋白,兩

10、種方法的轉(zhuǎn)膜液不同！,Western Blot 的具體步驟,4.轉(zhuǎn)膜,表5 PVDF膜、NC膜、尼龍膜特點(diǎn)比較,Western Blot 的具體步驟,4.轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備,制作“三明治”,Western Blot 的具體步驟,4.轉(zhuǎn)膜,Western Blot 的具體步驟,4.轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件： 推薦：100V ，12小時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。,Western Blot 的具體步驟,5.轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)：（立春紅染色）,為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜是否成功，可用相關(guān)染料對(duì)膜進(jìn)行染色。,1x立春紅 5min,染色前,染色后,Western Blot 的具體步驟,6.封閉,封閉條件： 4C搖動(dòng)，封閉1 hou

11、r，再用 TBST洗5秒，進(jìn)入下一步抗體的孵育。,為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進(jìn)行膜的封閉，常用的封閉液：,脫脂奶粉（5） BSA（5） Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供）,不能用于磷酸化蛋白！,Western Blot 的具體步驟,7.免疫反應(yīng),1.按照抗體說(shuō)明書(shū)建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋抗體； 2.抗體孵育時(shí)間：室溫下孵育12h或4過(guò)夜（一般不超過(guò)18小時(shí)）； 3. 保持適當(dāng)?shù)膿u動(dòng)使抗體與膜的結(jié)合均勻；,Western Blot 的具體步驟,7.免疫反應(yīng),擺床上，二抗雜交，室溫（25左右）1h，或4過(guò)夜。,PBST(TBST)洗滌3次

12、，每次10分鐘。,上二抗,Western Blot 的具體步驟,7.免疫反應(yīng),不同二抗稀釋濃度的效果圖,Western Blot 的具體步驟,8.顯色（結(jié)果檢測(cè)）,暗室操作！,Western Blot 的具體步驟,8.顯色（結(jié)果檢測(cè)）,滴加ECL工作液,顯影、定影,Western Blot一般流程,蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 二抗雜交 底物顯色,操作步驟,（一） 蛋白樣品制備 （二） 蛋白含量的測(cè)定,（三） SDSPAGE 電泳,1） 清洗玻璃板： 一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。,

13、（2 ） 灌膠與上樣,1、玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）,2、按前面方法配 10分離膠，加入TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)， 可用 10ml 槍吸取 5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。 然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）,3、當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。,4、配4 的濃縮膠,加入TEMED

14、后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。,5、用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）,7、加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。） 用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太

15、快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。,（3） 電泳,電泳時(shí)間一般45 h，電壓為40V 較好，也可用 60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。,（四） 轉(zhuǎn)膜,（1） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 6 張7.08.3cm 的濾紙和1 張7.38.6cm 的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h 才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。 若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣

16、膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。,（2 ） 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和 浸過(guò)的膜。 （3） 將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以 搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊 三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去 其中的氣泡。,（4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。 撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。 小心剝下分離膠蓋于濾

17、紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。 將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門以使空氣流通。）,（5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。 轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用 60V 轉(zhuǎn)移2 h 或40V 轉(zhuǎn)移 3 h。,(五) 封閉及雜交,1封閉： 將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒(méi)于封閉

18、液中緩慢搖蕩一小時(shí)。必要時(shí)可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。,2結(jié)合一抗： 一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時(shí)每張39cm2膜約需2ml一抗稀釋液。 反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4靜置過(guò)夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤(rùn)平皿以防止液體過(guò)多蒸發(fā)。,3洗滌： 一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。,4結(jié)合二抗： 根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗，根據(jù)