1、第四章 種子的擴(kuò)大培養(yǎng),種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求,種子制備實(shí)例,種子制備的技術(shù)概要,種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。,種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求,種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念:,種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的,接種量的需要,菌種的馴化,縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平,種子的要求：,總量及濃度能滿足要求,生理狀況穩(wěn)定，個體與群體,活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長,無雜菌污染,種子制備過程舉例,一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備,制備過程,斜面菌種,一級種子培養(yǎng),二級種子培養(yǎng),發(fā)酵,1、

2、斜面 (AS1.299),培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5 瓊脂 2%， pH 7.0-7.2,培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì),培養(yǎng)條件：32，生長18-24小時,生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過 3次,2. 一級種子（搖瓶）,培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32培 養(yǎng)12小時。,培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1%,培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基 本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基,3. 二級種子(種子罐),培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%）， 32培養(yǎng)7-10個小時,

3、培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%,培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基,種子的質(zhì)量要求：,108-109個/ml 大小均勻，呈單個或八字排列 pH 7.0-7.2(結(jié)束時)，6.887.0-7.2 活力旺盛,二、青霉素生產(chǎn)的種子制備,制備過程,安培管, 斜面孢子, 大米孢子, 一級種子, 二級種子, 發(fā)酵,1、斜面孢子,培養(yǎng)基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于長孢子，用量少而精細(xì),培養(yǎng)條件：25、7天, 注意濕度50%左右,2、大米孢子,培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）,培養(yǎng)基的特點(diǎn)：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當(dāng)（要求大米

4、的白點(diǎn)?。┯欣阪咦拥纳L。,培養(yǎng)條件：25、7天，控制濕度,大米孢子的要求：1粒米含1.4106個孢子,3、一級種子,培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿,目的：長菌體,培養(yǎng)條件：27，40小時,接種量：200億孢子/噸,4、二級種子,培養(yǎng)基：同上,培養(yǎng)條件：27、10-14小時,接種量：10%,種子的質(zhì)量要求,菌絲長稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于期,青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強(qiáng),種子制備的技術(shù)概要,種子制備的過程,實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將

5、這些培養(yǎng)過程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。,生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。,實(shí)驗(yàn)室階段,1、培養(yǎng)物選擇的原則,目的：種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點(diǎn)最終的培養(yǎng)物可分為兩類：,對于不產(chǎn)孢子和芽胞的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體,對于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實(shí)驗(yàn)室階段的種子擴(kuò)培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。,獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子,菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。,對于產(chǎn)孢子的微生物,獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體,便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。,2、培養(yǎng)基選擇的原則

6、,培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。,在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。,3、起始接種物的傳代問題,細(xì)菌,保藏斜面 活化斜面,產(chǎn)孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。,母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。 所以接種時要稀一點(diǎn)、便于純化生長到單菌落。,子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接種：從母斜面上點(diǎn)接種，選取生長好的單菌落 接種時密一點(diǎn)，得到大量的孢子。,孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月,孢子培養(yǎng),生產(chǎn)車間階段,1、培養(yǎng)物的選擇原則,在生

7、產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。,縮短發(fā)酵時間,有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果,菌絲體比孢子要有利：直接生長，孢子還需要萌發(fā),2、培養(yǎng)基選擇的原則,目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。,在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因: 一 成本 二 馴化,例：檸檬酸發(fā)酵,以蔗糖為原料,成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl

8、0.015% 瓊脂 2%,薯干粉,成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 薯干粉 10% 22-28% (NH4)2SO4 0.5% 瓊脂 2%,3、發(fā)酵級數(shù)的確定,谷氨酸：三級發(fā)酵,一級種子（搖瓶）二級種子 （小罐）發(fā)酵,青霉素：三級發(fā)酵,一級種子 （小罐）二級種子（中罐）發(fā)酵,一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù),發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù),級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響,級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一 般2-4級。,在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要 的一個方面,4、接種量的確定,移入種子的體積 接種量 接種后培養(yǎng)液的體積,過大過小都不好，最終以實(shí)踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。,雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。,倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。,5、種齡,種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。,種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。,原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。,6、種子的質(zhì)量要求：,量：要求達(dá)到一定的濃度,質(zhì): 形態(tài) （生長處于某個階段、均勻等等） 理化指標(biāo)：C、N、P的含量，pH