1、漁業(yè)水體中五氯苯酚的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所2020年6月目錄1概述11.1 背景及意義11.2 國(guó)內(nèi)外研究概況41.3 研制的基本思路62現(xiàn)有條件63 標(biāo)準(zhǔn)制定的依據(jù)及思路73.1 樣品的采集及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與儲(chǔ)存73.2 水樣預(yù)處理?xiàng)l件的確定73.3 固相萃取條件的優(yōu)化83.3.1 固相萃取柱的選擇93.3.2 洗脫劑的選擇103.3.3 洗脫劑的用量103.4 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化113.4.1色譜條件113.4.2質(zhì)譜條件134 方法的效能指標(biāo)144.1 方法的定量限144.2 方法的線性范圍154.3 方法的準(zhǔn)確度、精密度與適用范圍1

2、64.4 與HJ 591-2010水質(zhì) 五氯酚的測(cè)定 氣相色譜法的比較205 結(jié)論206 與有關(guān)法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系217 作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)的建議218 標(biāo)準(zhǔn)在編制過(guò)程中意見(jiàn)分歧情況21湖南省地方標(biāo)準(zhǔn) 漁業(yè)水體中五氯苯酚的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明根據(jù)湖南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于公布2019年度第1批地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知（湘市監(jiān)辦字201959號(hào)），湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所承擔(dān)“漁業(yè)水體中五氯苯酚的測(cè)定方法研究”的湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)制定工作。本標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中的全部試驗(yàn)工作現(xiàn)已完成，標(biāo)準(zhǔn)起草小組起草了征求意見(jiàn)稿，現(xiàn)對(duì)漁業(yè)水體中五氯苯酚的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法征

3、求意見(jiàn)稿的編制工作做如下說(shuō)明：1概述1.1 背景及意義五氯苯酚(pentachlorophenol,PCP),簡(jiǎn)稱五氯酚，分子式C6Cl5OH,結(jié)構(gòu)式如圖1所示，分子量266.32,熔點(diǎn)191,沸點(diǎn)310/分解,相對(duì)密度(水=1)1.98,薄片或結(jié)晶狀,有臭味,難溶于水,易溶于甲醇、丙酮、乙醚等大多數(shù)有機(jī)溶劑。五氯苯酚的pKa=4.71,在中性和堿性溶液中可解離成離子形態(tài),而在酸性溶劑中主要以分子形態(tài)存在。圖 1 五氯苯酚的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of PCP.五氯苯酚是一種毒性較強(qiáng)的氯代酚類物質(zhì),因其具有高效、殺蟲(chóng)譜廣、成本低、使用方便等特點(diǎn)，自20世紀(jì)3

4、0年代以來(lái)作為殺蟲(chóng)劑、除草劑、木材防腐劑在全球范圍內(nèi)廣泛使用1。我國(guó)從20世紀(jì)50年代開(kāi)始廣泛將五氯苯酚運(yùn)用于于農(nóng)業(yè)及日常生活各個(gè)方面。由于其鈉鹽易溶于水，使用方便，60年代初曾在長(zhǎng)江中下游的血吸蟲(chóng)疫區(qū)大量使用，用以殺滅寄生血吸蟲(chóng)的中間宿主釘螺及其它軟體動(dòng)物2。五氯苯酚化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,其殘留物在環(huán)境中降解緩慢，容易在動(dòng)植物體內(nèi)富集,造成環(huán)境污染和生物蓄積。五氯苯酚對(duì)人和哺乳動(dòng)物毒性大，經(jīng)呼吸系統(tǒng)吸入或經(jīng)皮膚吸收會(huì)引起內(nèi)分泌紊亂、呼吸困難、肝腎損壞、不孕等病癥，高劑量時(shí)可產(chǎn)生胚胎毒性，其存在短期明顯的毒性和長(zhǎng)期潛在的毒性作用3,4。五氯苯酚對(duì)水生生物具有明顯的生物毒性，尤其是魚(yú)類和貝類，環(huán)境中較低

5、濃度的五氯苯酚易在動(dòng)植物體內(nèi)富集，具有極大的潛在危害。鑒于五氯苯酚對(duì)生物的毒性和對(duì)環(huán)境的危害性，許多機(jī)構(gòu)和國(guó)家將其列為禁用或限用的污染物。五氯苯酚在1991年被美國(guó)聯(lián)邦列為31種最危險(xiǎn)物質(zhì)之一；國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationalResearch Agency for Cancer，IRAC）將五氯酚歸類為2B 類致癌物；美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（Environmental Protection Agency，EPA）將它列為優(yōu)先控制的環(huán)境有機(jī)污染物、持久性有機(jī)污染物(persistent organic Pollutants，POPs)，限制其只用于木制品的防腐。歐盟于1992年起限制使用，2

6、0 世紀(jì)70-90 年代奧地利、印度、印尼、新西蘭、瑞典、瑞士等國(guó)也相繼將其列入禁用范圍。中國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002發(fā)布了農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單和 NY 5071-2002無(wú)公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則，明確要求動(dòng)物食品生產(chǎn)加工中禁用五氯苯酚。五氯苯酚曾作為常用的殺滅血吸蟲(chóng)中間宿主-釘螺的藥物，在長(zhǎng)江中下游長(zhǎng)時(shí)間施用。一方面，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，不可避免的在養(yǎng)殖環(huán)境中產(chǎn)生殘留，前期施用的五氯苯酚對(duì)漁業(yè)環(huán)境造成的影響還會(huì)持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間。水體和底泥中殘留的 五氯苯酚 及其鈉鹽會(huì)富集到水生生物體內(nèi)。另一方面，雖然我國(guó)已明確將 五氯苯酚 列入禁用藥物的范圍，但但張彤晴

7、等5調(diào)查報(bào)告顯示，在漁業(yè)生產(chǎn)中仍有部分漁民仍使用 五氯苯酚 殺滅雜魚(yú)進(jìn)行清塘，導(dǎo)致五氯苯酚在養(yǎng)殖對(duì)象體內(nèi)富集，對(duì)漁業(yè)產(chǎn)品的安全性存在一定的威脅。國(guó)內(nèi)外對(duì)漁業(yè)環(huán)境中五氯苯酚的濃度和含量的研究報(bào)道6-8顯示，五氯苯酚 的含量為各種氯代酚之首，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它氯代酚濃度，對(duì)人類以及動(dòng)植物存在一定的危害。因此，評(píng)估漁業(yè)水體中的五氯苯酚殘留狀況，建立相應(yīng)的分析方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于監(jiān)測(cè)漁業(yè)水體中五氯苯酚的含量以及水產(chǎn)品中五氯苯酚污染來(lái)源的排查具有積極的意義。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的五氯苯酚的檢測(cè)方法有分光光度法、免疫法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 116

8、07-89）對(duì)五氯酚鈉在漁業(yè)水體中的最高限量值為0.01 mg/L，推薦的測(cè)定方法為氣相色譜法（HJ 591-2010 ）。該方法樣品前處理過(guò)程需要進(jìn)行多次液液萃取和衍生化反應(yīng)，操作過(guò)程繁瑣耗時(shí)，靈敏度和精密度有待提高。目前國(guó)家和農(nóng)業(yè)部尚未頒布檢測(cè)漁業(yè)水體中五氯苯酚的液質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方法，我省也沒(méi)有相關(guān)的地方標(biāo)準(zhǔn)，因此建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)漁業(yè)水體中五氯苯酚的測(cè)定方法顯得尤為重要，不僅可以為漁業(yè)主管部門提供更有效的水質(zhì)監(jiān)測(cè)手段，同時(shí)也可完善我國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。1.2 國(guó)內(nèi)外研究概況液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜以其分離速度快、靈敏度高、抗干擾能力好等特點(diǎn)，成為農(nóng)殘分析的新技術(shù)，適合環(huán)境介質(zhì)中農(nóng)藥殘留

9、的快速篩查和測(cè)定9。Sarrin等10采用固相微萃取技術(shù)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種同時(shí)測(cè)定環(huán)境樣品中19種氯酚的方法。目標(biāo)化合物采用APCI源離子化和固相微萃取富集，萃取效率和離子化效率更高，適用于木頭和工業(yè)廢油中氯酚含量的準(zhǔn)確靈敏檢測(cè)。 Marchesex等11建立了一種采用固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定地表水中5種氯酚的（鄰氯苯酚、4-氯-3-甲基苯酚、2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚）的新方法。該方法檢出限低（10 ng/L），回收率高（91%-110%）,精密度好（RSD10%）。水體中的氯酚采用HLB固相萃取柱富集和凈化，取樣量為2 L水，活

10、化和洗脫溶劑為甲醇，操作較簡(jiǎn)單，但取水量大，過(guò)柱時(shí)間長(zhǎng)，不利于大批量水樣的預(yù)處理。金米聰?shù)?2建立了一種簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定水中痕量五氯酚的固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法,并用于生活飲用水、漁塘水中痕量五氯酚的污染監(jiān)測(cè)。水樣經(jīng) Oasis HLB小柱富集,以甲醇-甲基叔丁基醚(10+90)洗脫,采用甲醇和2 mmol/L 醋酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度淋洗 ,以ZORBAX Eclip se XDB-C18柱(150 mm 211 mm 5m)分離,通過(guò)選擇性離子檢測(cè)(SIM)及電噴霧電離離子化技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。該方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，適合地表水中五氯苯酚的測(cè)定。洪愛(ài)華等13建立了一種

11、高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法準(zhǔn)確、靈敏測(cè)定飲用水中五氯苯酚的方法。該方法采用 Oasis HLB 柱進(jìn)行固相萃取對(duì)水樣進(jìn)行富集凈化，不需要復(fù)雜的衍生化操作，前處理方法簡(jiǎn)便快速，并且短時(shí)間內(nèi)即可得到定性、定量檢測(cè)結(jié)果，適合飲用水中 五氯苯酚 含量的測(cè)定。楊秋紅等14建立了簡(jiǎn)便、快速、同時(shí)測(cè)定地表水中,二 氯 酚、,三氯酚和五氯酚的固相萃取高效液相串聯(lián)質(zhì)譜方法。固相萃取小柱富集水樣中待測(cè)物質(zhì)，經(jīng)二氯 甲 烷丙 酮（，）混合溶液洗脫后，氮吹濃縮，用甲醇復(fù)溶，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、精密度好、干擾小的特點(diǎn)，適用于集中式生活飲用水地表水水源地特定項(xiàng)目中的污染物的

12、檢測(cè)。唐雪15建立了使用超高效液相色譜儀-三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用測(cè)定生活飲用水中氯酚類物質(zhì)(2，4-二氯酚，2，4，6-三氯酚，五氯酚)的方法。該方法生活飲用水及水源地地表水濾過(guò)后即可上機(jī)分析，無(wú)需衍生，操作簡(jiǎn)單。陳曉紅等16建立了一種采用兩親性聚離子液體膜微萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水中種氯酚的含量。該方法操作簡(jiǎn)單，檢出限低，回收率高，但所使用的兩親性聚離子液體膜材料為實(shí)驗(yàn)室自己合成，操作要求高，無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用于實(shí)際水體中五氯苯酚的檢測(cè)。目前，有關(guān)水體中五氯苯酚測(cè)定的研究報(bào)道不斷深入，但國(guó)家一直還沒(méi)有漁業(yè)水體中五氯苯酚測(cè)定的液質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，為確保環(huán)境安全與人民的身體健康，有效打擊養(yǎng)殖中非法使用，建立

13、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法，測(cè)定漁業(yè)水體中五氯苯酚的檢測(cè)方法顯得尤為重要。1.3 研制的基本思路本方法結(jié)合國(guó)內(nèi)外關(guān)于水體中五氯苯酚檢測(cè)方法、文獻(xiàn)報(bào)道及試驗(yàn)室的條件初步制定了漁業(yè)水體中五氯苯酚的檢測(cè)方法。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化前處理、色譜以及質(zhì)譜條件，以提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。2現(xiàn)有條件農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（長(zhǎng)沙）通過(guò)農(nóng)業(yè)部和國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局組織的雙認(rèn)證考核。“中心”是國(guó)家計(jì)量認(rèn)證和農(nóng)業(yè)部審查認(rèn)可的具有第三方公正性地位的漁業(yè)水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)法定機(jī)構(gòu)?！爸行摹爆F(xiàn)有17名工作人員，其中技術(shù)人員16人，碩士研究生8人，高級(jí)職稱6人，中級(jí)職稱7人?！爸行摹睋碛蠺hermo TSQ

14、Quantum液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、Termo Q-Exactive Focous液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀以及安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀等大中型儀器68余套臺(tái)，價(jià)值近2000萬(wàn)元；“中心”每年不但承擔(dān)了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳下達(dá)的檢測(cè)任務(wù)，還承接了社會(huì)委托的各種檢測(cè)任務(wù)，為保證我省漁業(yè)產(chǎn)品及漁業(yè)環(huán)境做出了應(yīng)有的貢獻(xiàn)。為保證能較好的完成漁業(yè)水體中五氯苯酚的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)的制定，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（長(zhǎng)沙）非常重視，成立編制小組，由萬(wàn)譯文同志全面主持工作，從宏觀上把握標(biāo)準(zhǔn)的制定宗旨，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)編制小組各成員進(jìn)行了明確的分工，并將責(zé)任落實(shí)到人，且定期召開(kāi)標(biāo)準(zhǔn)

15、編制小組會(huì)議，及時(shí)總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3 標(biāo)準(zhǔn)制定的依據(jù)及思路本標(biāo)準(zhǔn)制定的主要原則，一是本標(biāo)準(zhǔn)要符合國(guó)家有關(guān)方針、政策、法律和規(guī)章的要求，要符合國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定和要求；二是本標(biāo)準(zhǔn)要具有科學(xué)性、可操作性、推廣型和實(shí)用性；三是本標(biāo)準(zhǔn)要能保證漁業(yè)水質(zhì)的養(yǎng)殖用水安全，又有利于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)和產(chǎn)地認(rèn)證工作。3.1 樣品的采集及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與儲(chǔ)存水質(zhì)樣品的采集和制備參照SL 187水質(zhì)采樣技術(shù)規(guī)程進(jìn)行采集。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法，參照了HJ 591-2010水質(zhì) 五氯酚的測(cè)定 氣相色譜法五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法，結(jié)合本試驗(yàn)檢測(cè)的實(shí)際情況，采用農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所的有證標(biāo)準(zhǔn)

16、物質(zhì)（五氯酚100 mg/L）作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，該溶液經(jīng)逐級(jí)稀釋配制成濃度為50 g/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和標(biāo)準(zhǔn)中間溶液置于-4冰柜避光中保存。臨用前將標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋成一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供上機(jī)測(cè)定。3.2 水樣預(yù)處理?xiàng)l件的確定五氯苯酚的pKa=4.71，在中性和堿性溶液中可解離成離子形態(tài),而在酸性溶劑中主要以分子形態(tài)存在。預(yù)處理水樣酸堿度的變化會(huì)直接影響五氯苯酚的分子解離和帶電荷狀況，進(jìn)而影響后續(xù)的HLB柱固相萃取效果。在50 mL空白水樣（pH為6.85）中添加五氯苯酚濃度為50 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL后，渦旋混勻，得到濃度為0.20 g/L的加標(biāo)水樣。分別通過(guò)甲酸或氨

17、水將水樣的pH調(diào)節(jié)至1, 3, 5, 7, 9, 11，經(jīng)HLB柱固相萃取處理后上機(jī)測(cè)試分析后比較預(yù)處理水樣pH對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，過(guò)低或過(guò)高的pH均可造成目標(biāo)物的回收率降低，當(dāng)pH=3時(shí)，五氯苯酚的回收率最高，故本試驗(yàn)選擇水樣pH=3為水樣預(yù)處理?xiàng)l件。表1 水樣pH對(duì)五氯苯酚回收率的影響（n=3）Table 1 Effect of pH on the recovery of PCP（n=3）目標(biāo)物平均回收率（%）pH=1pH=3pH=5pH=7pH=9pH=11五氯苯酚72.594.887.284.178.470.33.3 固相萃取條件的優(yōu)化對(duì)于水樣來(lái)說(shuō)，目

18、標(biāo)分析物的含量很低，分析的要求是較高的萃取效率。萃取回收率的大小會(huì)隨著固相萃取條件變化而變化，選擇不當(dāng)?shù)墓滔噍腿l件會(huì)直接影響一些樣品的檢出，所以必須優(yōu)化固相萃取條件。本試驗(yàn)主要考察了3個(gè)對(duì)回收率影響大的固相萃取條件，即固相萃取柱、洗脫劑的選擇和洗脫劑的用量。通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)確定了最佳固相萃取條件。3.3.1 固相萃取柱的選擇本實(shí)驗(yàn)采用了C18(500 mg，6 mL)、ENVI-Chrom(250mg，6 mL)、HLB(200 mg，6 mL)3種固相萃取小柱對(duì)五氯苯酚的萃取效率進(jìn)行了研究。采用3種固相萃取柱分別對(duì)濃度為0.20 g/L的加標(biāo)水樣進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，平行測(cè)定3次。結(jié)果如表2所示

19、，采用HLB柱的平均加標(biāo)回收率為92.5%，明顯高于采用C18柱和ENVI-Chrom柱的平均加標(biāo)回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HLB柱對(duì)五氯苯酚的富集效果優(yōu)于C18柱和ENVI-Chrom柱，因此，本試驗(yàn)選擇HLB固相萃取小柱。表2 不同的固相萃取柱對(duì)五氯苯酚回收率的影響(n=3)Table 2 Effect of different SPE columns on recovery of PCP(n=3)目標(biāo)物平均加標(biāo)回收率/%C18ENVI-ChromHLB五氯苯酚65.379.091.5為了進(jìn)一步探求不同品牌的HLB固相萃取柱對(duì)五氯苯酚萃取效率的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了三個(gè)主流品牌的HLB固相萃取

20、小柱（Waters Oasis, 200 mg, 6 mL; Simon Aldrich, 150 mg, 6 mL; CNW Poly-Sery, 200 mg, 6 mL;）對(duì)0.20 g/L的加標(biāo)水樣中目標(biāo)物萃取回收率的影響（如表3所示)。結(jié)果表明，不同生產(chǎn)廠商的C18固相萃取小柱對(duì)水樣中五氯苯酚的萃取率沒(méi)有顯著差異。表3 不同品牌的C18固相萃取柱對(duì)五氯苯酚回收率的影響(n=3)Table 3 Effect of different C 18 SPE columns on recovery of PCP(n=3)目標(biāo)物平均加標(biāo)回收率/%品牌Waters OasisSimon Aldri

21、chCNW五氯苯酚92.388.590.13.3.2 洗脫劑的選擇選擇合適的洗脫劑將目標(biāo)物從吸附劑上洗脫下來(lái)是整個(gè)萃取過(guò)程的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)選擇甲醇 、乙腈、二氯甲烷、丙酮作為洗脫劑 ,考察對(duì)富集在HLB固相萃取柱內(nèi)的五氯苯酚洗脫效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，五氯苯酚在甲醇 、乙腈、二氯甲烷、丙酮四種洗脫劑洗脫下，回收率分別為93.0%、73.4%、75.0%、81.7%，甲醇的洗脫效果明顯優(yōu)于乙腈、二氯甲烷和丙酮，故選擇甲醇作為洗脫劑。表4 不同的洗脫劑對(duì)五氯苯酚回收率的影響 (n=3)Table 4Effect of different eluents on recovery of

22、PCP (n=3)目標(biāo)物平均加標(biāo)回收率/%甲醇乙腈二氯甲烷丙酮五氯苯酚93.073.475.081.73.3.3 洗脫劑的用量洗脫劑用量少不能將目標(biāo)物從固相萃取柱上洗脫下來(lái)，洗脫劑用量多則造成洗脫劑浪費(fèi)，洗脫劑的量的選擇很重要。采用 HLB固相萃取小柱，甲醇為洗脫劑，考察洗脫劑用量（2，3，4，5，6和7 mL）對(duì)回收率的影響（圖2）。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫劑用量大于5 mL時(shí)，回收率較高，且相差不大。為了節(jié)約氮吹時(shí)間，提高效率，保證回收率，本實(shí)驗(yàn)洗脫劑用量選擇為5 mL。圖 2洗脫劑用量對(duì)五氯苯酚回收率的影響 (n=3)Fig.2 Effect of amount of eluents on re

23、covery of 五氯苯酚 (n=3)3.4 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化3.4.1色譜條件五氯苯酚的 pKa為4.93，當(dāng)溶液的pH4.93時(shí)，五氯酚的電離受到抑制，主要以分子形式存在。流動(dòng)相中加入甲酸能夠降低溶液pH值，使五氯酚以分子形式存在，并可降低色譜柱殘余硅羥基的活性，從而降低目標(biāo)化合物與硅羥基的次級(jí)相互作用，獲得較好的色譜峰形17。流動(dòng)相中加入乙酸銨可以提高五氯苯酚的離子化效率，從而提高靈敏度。實(shí)驗(yàn)比較了不同色譜條件下五氯苯酚的SRM色譜圖（如圖3所示），結(jié)果表明,當(dāng)流動(dòng)相為2 mmol/L 乙酸銨的水溶液和甲醇時(shí)，五氯苯酚的色譜峰峰型較寬，且色譜峰前沿；當(dāng)流動(dòng)相為0.1%(v/v)甲酸水

24、溶液+甲醇，五氯苯酚的色譜峰響應(yīng)較低；當(dāng)以含0.1%(v / v)甲酸的2 mmol/L 乙酸銨的水溶液和甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，五氯苯酚表現(xiàn)出最高的靈敏度和最好的色譜峰型。圖3 不同流動(dòng)相條件下五氯苯酚的SRM色譜圖。流動(dòng)相組成：（a）2 mmol/L 乙酸銨的水溶液+甲醇 ；（b）含0.1%(v/v)甲酸的2 mmol/L乙酸銨水溶液+甲醇；（c）0.1%(v/v)甲酸水溶液+甲醇Fig.3 SRM chromatograms of PCP.Mobile phases：(a) 2 mmol/L ammonium acetate+methanol, (b) 2 mmol/L ammonium ac

25、etate(containing 0.1% formic acide)+methanol, (c)0.1% formic acide+methanol3.4.2質(zhì)譜條件五氯苯酚是一種氯代酚類物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)上含有5個(gè)氯原子和1個(gè)羥基，容易失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，質(zhì)譜檢測(cè)采用負(fù)離子模式(M H-)可獲得較高的靈敏度。在ESI-模式下以流動(dòng)注射方式對(duì)五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,獲得化合物的分子離子(M-H-)，優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子傳輸毛細(xì)管溫度等參數(shù)。然后利用二級(jí)質(zhì)譜全掃描收集母離子對(duì)應(yīng)的的子離子信息，發(fā)現(xiàn)五氯苯酚分子離子(M-H-)在三重四極桿碰撞室中不易被打碎，特征子離

26、子(m/z 201.8、41.6、35.0）響應(yīng)強(qiáng)度較弱，不適合目標(biāo)物的靈敏檢測(cè)。由于五氯酚具有5個(gè)氯原子，氯元素存在35Cl與37Cl同位素，因此五氯苯酚的分子離子(M-H-)共有氯的4個(gè)同位素母離子對(duì)。根據(jù)王連珠等（參見(jiàn)附錄2）的研究?jī)?nèi)容，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.922016動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜法（參見(jiàn)附錄1），本實(shí)驗(yàn)選取相對(duì)豐度最強(qiáng)的母離子對(duì)264.7 / 264.7作為定量離子對(duì)，次強(qiáng)的母離子對(duì)(262.7 / 262.7、266.7 / 266.7， 268.7 / 268.7 )作為定性離子對(duì)，以獲得4個(gè)識(shí)別點(diǎn)，滿足確證要求。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)比研究了

27、選擇不同的特征離子對(duì)條件下五氯苯酚的SRM響應(yīng)大小，結(jié)果如圖4 所示。從圖4可知，特征子離子(m/z 264.7/201.8、264.7/41.6、264.7/35.0）響應(yīng)強(qiáng)度低，不適用于目標(biāo)物的靈敏檢測(cè)，而特征母離子264.7 / 264.7響應(yīng)強(qiáng)度高，選擇性好，適合作為五氯苯酚檢測(cè)的定量離子。圖4 五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（25.00 g/L）的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）色譜圖Fig.4 SRM chromatograms of the standard solution of PCP(25.0 g/L)4 方法的效能指標(biāo)4.1 方法的定量限本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）推薦的方法

28、確定方法定量限。計(jì)算過(guò)程如下： 式（1）式中：CL方法定量限；K置信因子，一般取10；Sb空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差；m標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度范圍內(nèi)的斜率；Si低濃度添加樣品響應(yīng)值（峰面積）的標(biāo)準(zhǔn)偏差；C低濃度添加樣品實(shí)際含量值；X平均低濃度添加樣品響應(yīng)值（峰面積）平均值。具體測(cè)定過(guò)程為：取20份空白水樣，分別添加低濃度的五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.10 g/L），按照本標(biāo)準(zhǔn)推薦的測(cè)定步驟進(jìn)行測(cè)定。按（1）計(jì)算得方法的定量限約為0.04 g/L。然后取6份空白水樣，分別添加0.04 g/L的五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按測(cè)定步驟進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的定量限的適用性，結(jié)果表明在定量限添加濃度下，方法的平均回收率在70-1

29、20%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，滿足方法的準(zhǔn)確度和精密度要求。4.2 方法的線性范圍本研究采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制一系列質(zhì)量濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測(cè)定。以分析物濃度為橫坐標(biāo)，定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得五氯苯酚的濃度在1.0050.0g/L范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5。表5 五氯苯酚的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 5 Regression equation and correlation coefficients（R2）of PCP分析物線性范圍回歸方程相關(guān)系數(shù)R2五氯苯酚

30、1.0050.0y=153493+132202x0.99834.3 方法的準(zhǔn)確度、精密度與適用范圍為考察本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度與適用范圍，進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。設(shè)0.04g/L、0.50g/L、5.00 g/L、10.0 g/L四個(gè)濃度添加水平，在空白水樣中添加五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平設(shè)六個(gè)平行，并設(shè)空白對(duì)照。具體操作為：分別量取空白水樣50 mL，添加一定體積的五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，按該標(biāo)準(zhǔn)的樣品前處理方法處理后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，按外標(biāo)法計(jì)算其濃度和回收率。加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，標(biāo)準(zhǔn)曲線、標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白對(duì)照及加標(biāo)樣品的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）色譜圖見(jiàn)圖5-圖9。從表6可以看

31、出，四個(gè)加標(biāo)濃度下五氯苯酚的回收率在83.0%-93.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明使用該方法測(cè)定漁業(yè)水體中的五氯苯酚準(zhǔn)確可靠。表 6 水樣中添加回收率及方法精密度試驗(yàn)（n5）Table 6Results of recoveries test and precision of the method from water samples添加濃度（g/L）平行樣五氯苯酚回收率（%）平均值（%）精密度（RSD%）0.04182.483.04.14279.3385482.6588.7680.10.50193.490.23.80290.2389.7488594.6685.35.00110189.4

32、7.01285.4387.2484587.1692.010.0193.193.26.562105.1392.6488.4589.2690.8圖5 五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖圖6 五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.50 g/L）的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）色譜圖圖7 五氯苯酚空白水樣的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）色譜圖圖8 空白水樣添加樣品（0.04 g/L）的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）色譜圖圖9 空白水樣添加樣品（0.50 g/L）的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）色譜圖4.4 與HJ 591-2010水質(zhì) 五氯酚的測(cè)定 氣相色譜法的比較我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607-89）對(duì)五氯酚鈉在漁業(yè)水體中的最高限量值為0.01 mg

33、/L，推薦的測(cè)定方法為氣相色譜法（HJ 591-2010）。與HJ 591-2010方法相比，本標(biāo)準(zhǔn)所推薦的檢測(cè)方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、 HJ 591-2010采用氣相色譜法，樣品前處理過(guò)程需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)和多次液液萃取，操作過(guò)程繁瑣耗時(shí)，不利于大批量樣品的檢測(cè)；本標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，水樣經(jīng)固相萃取進(jìn)行目標(biāo)物的富集和凈化，樣品前處理簡(jiǎn)單快速，適合大批量樣品的檢測(cè)。2、 HJ 591-2010法取樣量為100 mL水樣時(shí)，毛細(xì)管氣相色譜法的定量限為0.04 ug/L；本檢測(cè)方法取樣量為50 mL水樣時(shí)，即可達(dá)到HJ 591-2010法相應(yīng)的靈敏度。3、 HJ 591-2010法樣品前處

34、理使用的有毒有害試劑種類較多，用量較大；本檢測(cè)方法樣品前處理使用的有毒有害試劑種類和用量少，對(duì)分析檢測(cè)人員身體健康影響小，對(duì)環(huán)境更友好。5 結(jié)論高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定漁業(yè)水體中五氯苯酚，方法簡(jiǎn)單、易于操作，靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度均符合要求，可用于漁業(yè)水體中五氯苯酚的檢測(cè)。6 與有關(guān)法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系在標(biāo)準(zhǔn)的制訂過(guò)程中嚴(yán)格貫徹國(guó)家有關(guān)方針、政策、法律和規(guī)章等，嚴(yán)格執(zhí)行強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。與相關(guān)的各種基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，遵循了政策性和協(xié)調(diào)統(tǒng)一性的原則。7 作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)的建議本標(biāo)準(zhǔn)為化學(xué)分析檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，并不涉及有關(guān)國(guó)家安全、保護(hù)人體健康和人身財(cái)產(chǎn)安全、環(huán)境質(zhì)量要求等有關(guān)強(qiáng)制性地方

35、標(biāo)準(zhǔn)或強(qiáng)制性條文等八項(xiàng)要求，因此，建議將其作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)頒布實(shí)施。8 標(biāo)準(zhǔn)在編制過(guò)程中意見(jiàn)分歧情況本標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)編制和復(fù)核過(guò)程中，沒(méi)有意見(jiàn)分歧。參考文獻(xiàn)1 許文青, 樊柏林, 陳明, 等. 五氯苯酚和五氯苯酚鈉毒性作用研究進(jìn)展J. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2011, 25(6): 596-600. 2 許曉國(guó). 江蘇金壇魚(yú)塘水、底泥、魚(yú)體和漁民血中五氯酚暴露水平研究D. 復(fù)旦大學(xué), 2010.3 Ramlow J M , Spadacene N W , Hoag S R , et al. Mortality in a cohort of pentachlorophenol manufactur

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