1、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應是一種將核糖核酸的反轉(zhuǎn)錄和核糖核酸的聚合酶鏈反應結(jié)合起來的技術。首先用逆轉(zhuǎn)錄酶從核糖核酸中合成第一條cDNA鏈，然后以cDNA為模板擴增合成目標片段。它可以用來測量基因表達的強度，并從很少的信使核糖核酸樣品中構(gòu)建大容量的cdna(互補脫氧核糖核酸)文庫。逆轉(zhuǎn)錄酶，聚合酶，基因模板，基因雙鏈，雜交雙鏈，繼續(xù)聚合酶鏈反應擴增，基因，基因，切斷基因鏈，基因，基因單鏈，基因，基因，基因，基因，基因，基因，聚合酶鏈反應擴增，1。樣品預處理，2。細胞裂解，(DEPC，二醚)結(jié)果，產(chǎn)生了多個用于檢測特定基因序列存在與否的聚合酶鏈反應產(chǎn)物。實時定量聚合酶鏈反應技術實時定量聚合酶鏈反應(又稱T

2、aqMan聚合酶鏈反應，以下簡稱FQ-聚合酶鏈反應)是由PE(Perkin Elmer)公司于1995年建立的，實時定量聚合酶鏈反應技術的原理(實時定量聚合酶鏈反應)，實時定量聚合酶鏈反應的定義是：在聚合酶鏈反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實現(xiàn)對整個聚合酶鏈反應過程的實時監(jiān)控和對初始模板的定量分析。區(qū)別于普通的聚合酶鏈反應，普通的聚合酶鏈反應技術：定量分析聚合酶鏈反應后的最終產(chǎn)品。實時定量聚合酶鏈反應技術：實時檢測聚合酶鏈反應擴增，在擴增的指數(shù)期內(nèi)對初始模板進行定量。熒光定量聚合酶鏈反應的化學原理，非特異性熒光標記：1 .SYBR綠色特異性熒光標記：2。TaqMan，(1)SYBR

3、Green方法，SYBR Green熔解曲線分析，SYBR Green方法的優(yōu)缺點，優(yōu)點：對DNA模板無選擇性，適用于任何DNA它非常靈敏且便宜，無需設計復雜的探針。(2)TaqMan探針法，TaqMan作用機理，TaqMan方法的優(yōu)缺點，探針：由于熒光探針的引入，實驗特異性顯著提高。探針設計一般應滿足以下條件：探針長度應約為2040個堿基，以確保結(jié)合特異性。氣相色譜堿基含量為40%，避免了單核苷酸序列的重復。避免與引物雜交或重疊。探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定性大于引物，因此探針的Tm值至少比引物高5倍。此外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性以及探針與引物之間的距離都會影響實驗結(jié)果。應用聚合酶鏈反應

4、技術、研究基因克隆、基因測序、分析突變、診斷細菌、病毒和寄生蟲、構(gòu)建基因圖譜用于診斷人類基因組工程、基因測序、表達圖譜、法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標本、分析腫瘤和檢測各種腫瘤。然而，由于其高靈敏度，實驗操作容易被污染，并出現(xiàn)假陽性。只要有少量病原體，聚合酶鏈反應擴增可以是陽性結(jié)果，但不能作為診斷依據(jù)。只有當一定數(shù)量的病原體存在時，它才具有臨床意義。因此，量化模板尤為重要。傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應無法量化，這限制了它的應用。然而，F(xiàn)Q聚合酶鏈反應技術開發(fā)的聚乙烯公司提供了解決這個問題的可能性。目前，該技術已應用于食品中丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、結(jié)核分枝桿菌和大腸桿菌等多種病原體的檢測。莫里斯等人用FQ聚合酶鏈反應

5、研究了黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中的丙型肝炎病毒。FQ聚合酶鏈反應技術可以在保持巢式聚合酶鏈反應高靈敏度的同時提高檢測效率，是檢測丙型肝炎病毒的一種有效方法。同時，F(xiàn)Q-聚合酶鏈反應可以檢測血清中病原體的濃度，為藥物治療和療效觀察提供參考。以前，檢測大腸桿菌的常規(guī)方法受到限制，因為它們繁瑣，需要大量的聚合酶鏈反應后處理，并且不能定量樣品。1996年，威特姆等人應用FQ聚合酶鏈反應檢測牛肉中大腸桿菌志賀毒素基因。他們?yōu)榇竽c桿菌的不同血清變體設計并應用了不同的探針，從而提高了實驗的特異性。同時，他們還優(yōu)化了探針相對于引物的位置、探針在反應溶液中的濃度以及鎂離子的濃度等實驗因素，以

6、提高實驗的準確性和精密度。由于TaqMan系統(tǒng)可以一次測量96管樣品，并且無需電泳和EB染色后處理即可準確定量模板，實際應用方便，從而提高了實驗的參考價值和應用價值。因此，這種實驗方法是食品檢測的一個突破。(2)意大利腫瘤研究所Gelmini等人利用FQ-聚合酶鏈反應技術檢測乳腺癌標本中的c-erbB-2基因(癌基因C-erbB-2是生長因子受體型家族成員之一)。C-erbB-2的過表達是乳腺癌患者預后不良和5年生存率低的指征。(3)基因表達的研究由于TaqMan系統(tǒng)和熒光探針的應用，基因的檢測比以前的方法如Northern印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應定量方法更方便、快速和準確。研究骨髓基質(zhì)血小板

7、生成素(TPO)在巨核細胞形成中的作用，以及TPO在特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、再生障礙性貧血(再障)和特發(fā)性血小板減少性紫癜(特發(fā)性血小板減少性紫癜)中的病理生理學意義。用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒測定正常人和ITP、AA、ET患者骨髓基質(zhì)細胞在ABI7700反應系統(tǒng)中的TPO基因水平，同時用酶聯(lián)免疫吸附法測定骨髓和外周血中的TPO濃度。結(jié)果顯示，ITP和AA患者的TPO基因水平顯著升高，而內(nèi)皮素患者的TPO基因水平正常。類固醇治療后，ITP患者的TPO基因水平下降。骨髓中TPO濃度與其基因水平有關。在正常人和ITP病患者中，TPO基因的表達水平也與巨核細胞計數(shù)相關。這個實

8、驗為闡明TPO的作用提供了基礎。(4)基因突變和多態(tài)性研究1997年美國Ibrahim等人用FQ聚合酶鏈反應研究了正常痘病毒的多態(tài)性。他們使用了一對能與正常痘病毒血凝素基因的一個DNA片段結(jié)合的引物，設計了兩個單核苷酸差異的寡核苷酸探針，然后進行了熒光標記實驗，成功地鑒定了兩個單核苷酸差異的痘病毒株系。該技術也可用于猴痘和病毒核酸疫苗的單核苷酸變異多態(tài)性研究。(5)在其他方面，日本的異野利用FQ聚合酶鏈反應研究了葉綠體成熟度與其基因組拷貝數(shù)之間的關系。他們用核基因Cab作為內(nèi)部參考來測量葉綠體基因rbc1的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)子葉出現(xiàn)后，葉綠體基因的拷貝數(shù)顯著增加，這將葉綠體基因拷貝數(shù)的增加與光誘導葉綠體成熟聯(lián)系起來。1998年，希金斯等人建立了一套熒光探針檢測鼠疫纖溶酶原激活物基因的實驗方法。綜上所述，F(xiàn)Q-聚合酶鏈反應作為一種核