1、核酸檢測在血液篩查中的應用,深圳市血液中心,血液篩查是否需要進行核酸檢測,無償獻血的新動態(tài),“定期無償獻血者是低危的獻血者”，但是“以體檢為目的定期無償獻血者是高危獻血者”而且這部分人群的獻血隊伍正在擴大。這部分人群窗口期的機率高于其他人群。因為在他們中間高危的傳播行為經(jīng)常發(fā)生。 經(jīng)過治療后的HBsAg轉陰，ELISA方法檢測陰性的獻血者。,NAT與ELISA互補,病毒變異 免疫靜默期 實驗操作失誤 病毒感染的窗口期,病毒檢測窗口期,血篩用NAT試劑與臨床用的不同,目的和要求不同,定性與定量 臨床使用核酸檢測主要目的是定量監(jiān)測，進行療效分析。 血篩用于病原體的定性篩查 靈敏度和特異性 臨床在漏

2、檢與誤差之間更重視誤差 血液篩查用核酸目的是保證用血安全，更重視漏檢 質(zhì)控要求不同 臨床用與血液篩查用質(zhì)控要求也不同。臨床試劑以定量準確和防止誤報為質(zhì)控目標 血篩用以防止漏檢為主要目的 陽性率也不同 臨床更多的陽性；血篩更多是陰性 對自動化要求不同 臨床更多用于病人,單人份檢測,標本量少 血篩更多用于正常人，因此檢測量不同，對自動化的要求也不同,血篩用NAT平臺的要求,靈敏度 HBV10IU/ml；HCV、HIV200IU/ml 特異性 核酸的特異性高，幾乎沒有方法學假陽性 但要防止污染 內(nèi)標（內(nèi)對照） 為避免假陰性，要求每管陽性質(zhì)控 自動化 大規(guī)模、高通量,關于靈敏度的幾個問題,廠家宣傳的靈

3、敏度均指單人份檢測，而非推薦pooling方案的實測靈敏度 實際應用靈敏度=宣傳靈敏度pooling數(shù) IU才有可比性：WHO標準品以及國家一級標準品均以IU為單位 HCV、HIV窗口期濃度高，因此對靈敏度要求較低。 美國FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被檢出 HBV的窗口期標本在30-300IU/ml之間，因此對靈敏度要求高 低于靈敏度也有檢出的可能，這與取樣幾率有關,血液篩查常用的NAT技術,核酸提取均使用磁珠法,磁珠提取的原理： 將磁珠上標記特異性吸附核酸的物質(zhì)特異性吸附核酸，并通過磁分離技術將病毒核酸從裂解液中提取出來 步驟： 裂解吸附洗滌洗滌洗滌洗

4、脫 優(yōu)點： 磁珠提取特異性高，受標本因素影響小，靈敏度高 易于實現(xiàn)自動化 缺點： 成本較高、并需要一定的儀器(半自動、全自動)。完全手工工作量太大,實時熒光定量PCR技術原理,所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中,引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖 。,實時熒光優(yōu)點,特異性好 引物、探針雙重保證特

5、異性 方法學假陽性很少 擴增檢測同時進行，速度快，且不對擴增產(chǎn)物進行處理，不易污染 熒光檢測靈敏度高 羅氏第二代的NAT試劑也是使用實時熒光檢測,內(nèi)標設計原理,內(nèi)標為一已知低含量的與模板擴增效率相似的一段DNA片段，將它加入PCR反應液中，與模板共同擴增，以反應每管真實的擴增情況，如果內(nèi)標和樣品都未擴增出結果，則表示該管擴增無效，應重新做。,內(nèi)標的作用：避免假陰性,內(nèi)標的種類： 同源、異源 內(nèi)標的作用： 真實反應擴增效率 避免假陰性：假陰性是目前血液篩查中最重視的問題之一，內(nèi)標全程進行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控,核酸檢測中遇到的問題與解決方案,人員素質(zhì)和清潔很重要,血篩用NAT對低濃度要求太高，高靈敏度的試

6、劑操作對人員要求高，同樣的平臺不同的實驗員有很大的差距。 平臺建立初期會有較大問題 對人員素質(zhì)要求與自動化程度成反比 實驗室及儀器清潔很重要 由于少有高濃度標本，因此大面積的污染不易發(fā)生。但由于試劑靈敏度高，如不隨時注意清潔，污染有積累效應，會出現(xiàn)散發(fā)性樣本污染，引起假陽性,采血樣管的處理,玻璃器皿在使用前應高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活。,標本匯集,利用STAR工作平臺,編制匯集軟件。 合理的Pooling方案,Pool

7、ing方案,靈敏度因素 檢出血液中最低的病毒含量與標本匯集數(shù)量呈正比 成本因素 試劑價格以test為單位，檢測單位成本與pooling方案有關 檢測標本量及檢測時間因素 擴增檢測量=提取量3(HBV、HIV、HCV) 與儀器密切相關,影響靈敏度因素,Pooling方案 內(nèi)標的濃度 標本的加樣量 磁珠的量和混勻 模板制作過程的損失和提取量,批質(zhì)控的選用及設定,使用低濃度樣本為批陽性質(zhì)控 由于有內(nèi)標進行每管陽性質(zhì)控，因此批陽性質(zhì)控主要目的是監(jiān)控實驗細微的系統(tǒng)誤差。因此陽性質(zhì)控濃度選擇要低 過低的質(zhì)控會影響工作，因此不宜使用最低靈敏度濃度 建議靈敏度的3-5倍較好 多陽性和陰性質(zhì)控 不宜固定位置，最

8、好隨機分布 由于有內(nèi)標，多陽性質(zhì)控偶有個別出現(xiàn)問題，實驗結果也有保證,內(nèi)標與結果的判定,內(nèi)對照（IC）使質(zhì)控成為每管質(zhì)控 使用雙免熒光，保證內(nèi)對照和樣本反應條件絕對一致 競爭性設計，保證受影響因素一致 結果判斷原則： 樣本檢測陽性，無診IC情況均報陽性 樣本檢測陰性： 內(nèi)對照陽性，可以報陰性結果 內(nèi)對照陰性，需要復檢 通過軟件自動判斷，但建議要人工復核,核酸實驗室管理軟件,在實驗室管理軟件的基礎上增加核酸檢測的管理模塊，實現(xiàn)計算機管理,檢驗結果自動控制。,NAT與ELISA檢測的配合,1 同步檢測 2 先做常規(guī)檢測，再做核酸檢測,自動化要求,保證質(zhì)量 核酸檢測對技術要求高，特別是血篩用對靈敏度

9、要求更高，所以自動化保證質(zhì)量的持續(xù)性 進入計算機管理系統(tǒng) 由于標本多，還要進行pooling。為便于管理，減少人為錯誤，最好使用全自動工作站，這樣POOLING號、標本號都統(tǒng)一自動記錄，不易搞錯 提高工作效率 降低工作強度,縮短實驗時間,自動化的進程,今后面臨的問題,降低檢測成本,實驗室建設成本 人員成本 管理成本 設備成本(各廠家的設備是否兼容，兼容性強的設備、試劑銷路好) 試劑成本 質(zhì)量成本,合理地進行集中化檢測,提高檢測質(zhì)量 降低檢測成本 集中的區(qū)域要考慮標本運送時間。,標本處理,標本留樣和處理：也是核酸檢測質(zhì)量控制體系中的重要環(huán)節(jié)，否則在檢測之前病毒核酸已降解，造成假陰性檢測結果。 臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快(3小時以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后必須在1小時內(nèi)分離血清。 全國艾滋病檢測技術規(guī)范用于核酸定性檢測時，采集的抗凝全血應在48h內(nèi)分離PBMC和血漿，否則應在2448h內(nèi)分離血漿和血細胞。,試劑的穩(wěn)定性,