1、第七章 分子發(fā)光分析法,基態(tài)分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能等)，電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，以發(fā)射電磁輻射(即光)的形式釋放能量。,分子發(fā)光：,分子 發(fā)光,+,電能,化學(xué)能,光能,生物活性參 與化學(xué)發(fā)光,電致發(fā)光,化學(xué)發(fā)光,光致發(fā)光,生物發(fā)光,熒光,磷光,第七章 分子發(fā)光分析法,分子發(fā)光：,光致發(fā)光：,第七章 分子發(fā)光分析法,第一節(jié) 分子熒光、磷光產(chǎn)生基本原理 第二節(jié) 熒光光譜與基本特征第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系第四節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程第六節(jié) 定量分析方法,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,一、分子基態(tài)、激發(fā)態(tài),二、電子自

2、旋多重度,三、激發(fā)態(tài)到基態(tài)的能量傳遞途徑,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,一、分子基態(tài)、激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)： 基態(tài)分子吸收能量后，價(jià)層電子躍遷到高能級(jí)的分子軌道上稱為電子激發(fā)態(tài) 。是分子的亞穩(wěn)定狀態(tài)。,基態(tài)： 在正常狀態(tài)下，分子處于最低能級(jí)的分子軌道上稱為基態(tài)。是分子的穩(wěn)定狀態(tài)。,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,二、電子自旋多重度,電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，分子中的電子可以處在不同的自旋狀態(tài),常用電子自旋多重度來描述。,M = 2S + 1,S是電子的總自旋量子數(shù),S為各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和。,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,單重態(tài)（M=1）：電子自旋都配對(duì)的分子的電子態(tài)稱為單重態(tài)，用“S”

3、表示。,三重態(tài)（M=3）：分子中的電子對(duì)的電子自旋平行的電子態(tài)稱為三重態(tài)，用“T”表示。,S2 T2 S1 T1 S0,(洪特規(guī)則),第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,三、激發(fā)態(tài)到基態(tài)的能量傳遞途徑,電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和非輻射躍遷(熱)等方式失去能量。,返回速度快的途徑，發(fā)生幾率大!,e,1. 振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10 -12 s。,(一)、非輻射躍遷,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,e,2. 內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重度的電子能級(jí)中, 相等能級(jí)間的非輻射能級(jí)交換。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時(shí)間10

4、-12 s。,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,e,3. 系間跨越：不同多重態(tài)在有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。電子自旋改變，躍遷禁阻，通過自旋-軌道耦合等躍遷。,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,4. 外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而損失能量回到基態(tài)的非輻射躍遷。 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,1. 熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，發(fā)射時(shí)間約為10-710-9 s 。 發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長。,e,(二)、輻射躍遷,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,2. 磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的

5、最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)。發(fā)光時(shí)間：10-4100s 。,e,S0 激發(fā)態(tài)振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨越振動(dòng)弛豫 T1 S0,第一節(jié) 分子熒光磷光產(chǎn)生基本原理,第二節(jié) 熒光光譜與基本特征,一、熒光激發(fā)光譜,二、熒光發(fā)射光譜,三、熒光光譜的基本特征,第二節(jié) 熒光光譜與基本特征,一、熒光激發(fā)光譜,固定熒光波長，改變激發(fā)光波長，測(cè)定不同波長的激發(fā)光激發(fā)所得到的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長曲線。,激發(fā)光譜相當(dāng)于熒光物質(zhì)的吸收光譜。,第二節(jié) 熒光光譜與基本特征,二、熒光發(fā)射光譜,固定激發(fā)波長，掃描發(fā)射波長，測(cè)定化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與不同發(fā)射波長曲線。,發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。,第二節(jié) 熒光光譜與基本特征,三、熒

6、光光譜的基本特征,（一）、Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。 產(chǎn)生原因： 1. 振動(dòng)弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生位移主要原因； 2. 基態(tài)不同振動(dòng)能級(jí)間振動(dòng)弛豫至最低振動(dòng) 能級(jí)； 3. 外轉(zhuǎn)換。,第二節(jié) 熒光光譜與基本特征,（二）、發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 熒光分子吸收不同波長的能量，電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，產(chǎn)生不同吸收帶，但都通過無輻射躍遷方式回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，產(chǎn)生波長一定的熒光。,第二節(jié) 熒光光譜與基本特征,（三）、熒光發(fā)射光譜與吸收光譜成鏡像關(guān)系 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與

7、分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,一、分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件,二、化合物的結(jié)構(gòu)與熒光,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,一、分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件,1. 具有合適的結(jié)構(gòu)：通常是含有苯環(huán)和稠環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子； 2. 具有一定的熒光量子產(chǎn)率。,熒光量子產(chǎn)率（）： 衡量熒光物質(zhì)發(fā)光能力。 它表示激發(fā)分子發(fā)射出熒光(或磷光) 的比例。,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,f,=,發(fā)射的光量子數(shù),吸收的光量子數(shù),f,=,發(fā)射熒光的分子數(shù),被激發(fā)的分子數(shù),第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，可用各過程的速率常數(shù)來表示熒光量子產(chǎn)率：,熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，取決于分

8、子結(jié)構(gòu)。,各種無輻射躍遷過程的速率常數(shù)之和。取決于分子所處的化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,二、化合物的結(jié)構(gòu)與熒光,（一）、 躍遷的類型,對(duì)于有機(jī)熒光物質(zhì):,n * max100 平均壽命10-510-7 s； * max104 平均壽命10-710-9 s S T速率kISC小。,* 是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。,* ,* n,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,（二）、 共軛效應(yīng),產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，熒光量子產(chǎn)率越高，向長波方向移動(dòng)。,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,（三）、 剛性平面結(jié)構(gòu),芴,f = 1,聯(lián)苯,

9、f = 0.2,1. 減少分子振動(dòng)，減小外轉(zhuǎn)換。 2. 增大分子吸光截面，增大摩爾吸光系數(shù)。,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,熒光黃,f = 0.92,酚酞,f = 0,第三節(jié) 熒光產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,（三）、 取代基效應(yīng),1. 給電子取代基加強(qiáng)熒光,-HN2，-NHR ，-NR2，-OH， -OR ，-CN,產(chǎn)生 p 共軛,2. 吸電子取代基減弱熒光,-C=O， -COOH ，-NO2,n * 躍遷， 摩爾吸光系數(shù)小，熒光發(fā)射弱，系間跨躍較大，同樣使熒光減弱，相應(yīng)磷光增強(qiáng)。,第四節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素,一、溶劑,二、溫度,三、溶液的PH值,四、內(nèi)濾光作用與自吸現(xiàn)象,五、熒光猝滅,第四

10、節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素,一、溶劑,主要表現(xiàn)為溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成對(duì)化合物的熒光發(fā)生變化。 *躍遷類型：激發(fā)態(tài)極性比基態(tài)大，溶劑極性增大，躍遷能量降低，發(fā)生紅移，熒光增強(qiáng)。 溶劑與熒光分子形成氫鍵、配位鍵主要影響熒光分子的存在型體、電離狀態(tài)，熒光強(qiáng)度和形狀均發(fā)生很大變化。,第四節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素,二、溫度,溫度升高，外轉(zhuǎn)換的幾率增加。熒光強(qiáng)度降低。,三、溶液的PH值,不同PH值下，熒光分子存在形式不同。,第四節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素,四、內(nèi)濾光作用與自吸現(xiàn)象,自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。,內(nèi)濾光作用：溶液中含

11、有能吸收熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光的組分，如色胺酸中的重鉻酸鉀。,第四節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素,五、熒光猝滅,熒光分子與溶劑分子或者其他分子之間存在相互作用，使得熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。,（一）、 碰撞猝滅-動(dòng)態(tài)猝滅,M* + Q M + Q + 熱量,激發(fā)態(tài)分子,猝滅劑,第四節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素,（二）、 生成化合物的猝滅-靜態(tài)猝滅,M + Q M Q,基態(tài)的熒光物質(zhì)與猝滅劑反應(yīng)生成非熒光的化合物，導(dǎo)致熒光的猝滅。,（三）、 氧的猝滅,氧對(duì)溶液熒光產(chǎn)生猝滅作用的原因比較復(fù)雜，可能包含著多種機(jī)理。,第四節(jié) 影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素,（四）、 自猝滅,熒光物質(zhì)的濃度較大時(shí)，會(huì)使熒光強(qiáng)度降低。,此

12、外，還有電荷轉(zhuǎn)移猝滅，光化學(xué)反應(yīng)猝滅等。,自猝滅可能有如下幾個(gè)原因： 1. 熒光物質(zhì)分子之間的碰撞能量損失; 2. 熒光物質(zhì)的自吸收; 3. 熒光物質(zhì)分子的締合。,第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程,Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì) 熒光、磷光化學(xué)/生物發(fā)光 美國瓦里安技術(shù)中國有限公司,第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程,一、熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)流程,二、磷光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)流程,第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程,一、熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)流程,光源,氙燈,激發(fā)單色器,樣品池,光電倍增管,數(shù)據(jù)處理 儀器控制,發(fā)射單色器,第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程,組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器、檢測(cè)器。 特殊點(diǎn)：

13、兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。,第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程,（一）、激發(fā)光源,氙燈、高壓汞燈，染料激光器。,（二）、單色器,激發(fā)單色器： 選擇激發(fā)光波長，用以分離出所需用的激發(fā)光。 發(fā)射單色器： 選擇熒光發(fā)射波長，用以濾去雜散光、瑞利光、拉曼光和雜質(zhì)所發(fā)射的熒光。,第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程,（三）、樣品池,I0,It,If,樣品池四面透光。,（四）、檢測(cè)器,光電倍增管。 檢測(cè)器的方向與激發(fā)光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的干擾。,第五節(jié) 分子發(fā)光光譜儀結(jié)構(gòu)流程,二、磷光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)流程,利用熒光和磷光發(fā)射壽命的差別,通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，來測(cè)定低溫磷光。,第六節(jié) 定量分析方法,二、定量方法,一、定量依據(jù),第六節(jié) 定量分析方法,一、定量依據(jù),熒光強(qiáng)度 If 正比于吸收的光強(qiáng)度 Ia 和熒光量子產(chǎn)率 ：,由朗伯-比耳定律得：,熒光強(qiáng)度 If ：,第六節(jié) 定量分析方法,對(duì)于