1、第六章 凝膠層析,凝膠層析的基本原理,凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì),凝膠層析的基本操作,凝膠介質(zhì)的選用原則,分子篩色譜（凝膠過濾）,Gel filtration chromatography,層析法所用的凝膠顆粒大小要均一，顆粒內(nèi)外貫穿許多小孔徑的通路，分子量小的物質(zhì)，比較容易進入顆粒中，因此被延滯流出。,對凝膠過濾介質(zhì)的要求,親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學或物理相互作用； 穩(wěn)定性強，在較寬的pH和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長， 具有一定的孔徑分布范圍； 機械強度高，允許較高的操作壓力（流速）。,凝膠特性參數(shù) 內(nèi)水體積Vi：孔體積 外水體積Vo：顆粒間體積 柱床體積

2、Vt Vt=Vo+Vi+ Vg Vt= Vi+Vo 洗脫體積Ve Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi,A：“全排阻”， 流經(jīng)體積Vo Kd=0 C：“全滲入”， 流經(jīng)體積Vo+Vi Kd=1 B：“部分排阻”或 Ve=Vo+KdVi 0 Kd1 Kd=(Ve-Vo)/Vi “排阻系數(shù)” 或“分配系數(shù)” 一定規(guī)格凝膠， Kd特征常數(shù),Kd1 物質(zhì)分子與凝膠之間有吸附 Tyr=1.4 G-25 小分子Kd1 水合作用 NaCl 0.8 G 0.9 整個凝膠作為固定相 Vi+Vg Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)=KdVi/(Vt-Vo) 有效分配系數(shù) 分子形狀不同M相近也可分開

3、 牛血清白蛋白（球）、兔血紅蛋白（棍） 68000d,凝膠特性參數(shù),排阻極限（exclusion limit） 是指不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量。例如Sephadex G50的排阻極限是30 kD。 分級范圍（fractionation range） 能被凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍。Sephadex G50的分級范圍為1.530 kD。,凝膠粒徑 凝膠一般為球形，其粒徑大小對分離度有重要影響。粒徑越小，分離效率越高。凝膠粒徑多用篩目或微米表示。軟凝膠粒徑較大，一般為50150 m（100200目），例如，Sepharose和Sephadex凝膠粒

4、徑分布為45165 m 。 硬凝膠粒徑較小，一般為550 m 。,床體積（bed volume） 即1 g干燥凝膠溶脹后所占有的體積。Sephadex G50的床體積為911 cm3/g干膠。 空隙體積（void volume） 即V0值?？障扼w積可用相對分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測定，一般使用平均相對分子質(zhì)量為2000 kD的水溶性藍色葡聚糖（blue dextran）。 對于商品化的凝膠過濾介質(zhì)，廠商的產(chǎn)品目錄中一般均給出其凝膠的各種性質(zhì)，如分級范圍、粒徑、流速與壓力的關(guān)系等，可參考使用。,GFC的優(yōu)點,溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收

5、率可接近100； 每批分離操作結(jié)束后不需要進行介質(zhì)的再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度； 作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性收率高； 分離機理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。,GFC的不足之處,僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進行分離，分離較慢、需嚴格控制流速； 經(jīng)GFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。因此需要在具有濃縮作用的單元操作（如超濾、離子交換和親和色譜等）后使用。,凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),葡聚糖系 其中Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)之一，目前仍被廣泛使用。Sephadex G是利用葡聚糖（右旋糖酐）交聯(lián)制備的，交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷。Sep

6、hadex凝膠按交聯(lián)度大小，分G 10G 200共八種型號。,性質(zhì) 對稀酸、稀堿、鹽溶液穩(wěn)定 濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110，干的則能耐受120高溫 交聯(lián)度穩(wěn)定性 凝膠含少量羧基，對陽離子輕微吸附，操作時使I0.02mol/l 芳香族、雜環(huán)化合物有時Kd1 新凝膠柱非特異性吸附蛋白，先用廉價較惰性蛋白飽和吸附、洗滌,規(guī)格編號 間接反映凝膠孔徑、滲入限、排阻限 G-50 分離限1500-30000 G-150：5000-400000 對蛋白、多糖分離范圍不同 （多糖分子體積比相同M的蛋白大） 粒度：直徑100-300um粗粒 20-80um細粒 40-120um中粒,保存 濕法：懸浮于水、緩沖液中，

7、0.02%NaN3，0-5 干法：乙醇分步處理（20%，40%，60%，80%） 脫水收縮，抽濾，60-80 吹干，室溫 半縮法：60-70%乙醇懸液，封口，4 ,修飾葡聚糖凝膠 親脂性 引入有機基團 Sephadex LH-20（羥丙基）（原Sephadex G-25） 流動相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機溶劑氯仿、四氫呋喃，因此適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過濾 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 引入CM-，DEAE-，離子交換、 分子篩,人工合成凝膠，控制凝膠總濃度和交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。,商品名為Bio-Gel，型號從P-2至P-300共10種（ 數(shù)字X1000就

8、相當于該凝膠的排阻限度） 特點：化學穩(wěn)定性好pH2-11， 無非特異性吸附， 不為微生物利用 粒度：粗150-300um 中75-150um 細40-75um 極細40um,聚丙烯酰胺凝膠,是由海藻多糖瓊脂中分離出來的天然凝膠， 常見的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B，數(shù)字代表 干膠的百分比 ）,Bio-Gel-A（美國）等,（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M， 數(shù)字X106代表排阻限度。,骨架各線性分子間以氫鍵相連，孔徑依賴于濃度,瓊脂糖凝膠,特點： 1.化學穩(wěn)定性差，pH4-9 2.脫水、干燥、冷凍、有機溶劑、溫度高于40

9、便融化 3.與硼酸形成配合物，孔徑變化，避免 4.強度低，隨凝膠濃度而，彈性小，調(diào)整柱壓 5.非特異性吸附力葡聚糖，I0.01mol/l無明顯吸附 6.分離的M范圍大（108），隨凝膠濃度而,架橋瓊脂糖凝膠 Sepharose CL 1，3-二溴丙醇交聯(lián)，孔徑均勻，孔徑大小和分離范圍與普通瓊脂糖一樣，但機械強度，熱穩(wěn)定性，化學穩(wěn)定性（pH3-14）,超膠（ultro-gel ACA) 瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠 比Sepharose 化學穩(wěn)定性好，強度高，pH3-10，熱穩(wěn)定性不變 ACA 34：丙烯酰胺3%，瓊脂糖4% 分離范圍：生物膠P超膠瓊脂糖,多孔玻璃微珠,Bio-Glas 500

10、孔徑500 將多孔硅酸鹽玻璃加工制得，粉末狀，可粘合 特點：化學穩(wěn)定性高，強度大，耐高壓， 對糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡鈍化,實驗操作 凝膠介質(zhì)的選擇,將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，其分離策略,是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。,類分離一般選用Sephadex G-25蛋白脫鹽（分子量范圍1000-5000）或選用G-50。,對于小肽和低分子量的物質(zhì)的脫鹽可選用Sephadex G-10、G-15（分子量范圍 -1500）、Bio-Gel P-2或P-4,類分離,凝膠介質(zhì)的選擇,將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開，,該策略是使M盡量在分離范圍的兩側(cè) 3個組分：

11、 Kd 0 0.5 1,在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠 內(nèi)部，但由于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。 分離血清蛋白可用G200 5000-800000 強度低 或G150 5000-400000,分級分離,粒度的選擇 細粒：流速低，洗脫峰窄，分辨率高，精制或分析 粗粒： 用于粗制、脫鹽,凝膠的預(yù)處理,將干膠顆粒懸浮于10倍以上吸液量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹。加熱可使溶脹加速，即在沸水浴5小時即可達到凝膠的充分溶脹。 加熱法既可節(jié)省時間又可排氣、消毒。 商品懸浮液去除保存液、抽濾、洗滌、平衡 不需溶脹,層析柱的選擇 柱比：長度/直徑、 體積 類分離： 柱床體積為樣品

12、體積5倍或略多 柱比5:1-10:1 分級分離：25-100倍 柱比25-100 大柱、長柱流速慢、稀釋嚴重、分辨率高,實驗室用的層析柱,工業(yè)用的層析柱,裝柱 1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出。 2.先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，將凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱的出口，使凝膠繼續(xù)沉集，裝柱完畢，關(guān)閉出水口。 不能出現(xiàn)分層、傾斜、氣泡,凝膠柱的平衡,通過2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。,上柱樣品溶液的體積

13、根據(jù)分離要求來確定：,進樣體積,進行組別分離時，樣品溶液最大可為柱體積的10%,進行分級分離時，樣品溶液的體積要小，這樣洗脫出的峰形好，蛋白類濃度4%,洗脫 用水、緩沖液、水-甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸 溫度、流速、柱壓、阻力恒定 防止非特異性吸附 操作壓流速快，峰寬 相當大柱壓范圍內(nèi) v=KP/L 相同操作壓，編號小，交聯(lián)度大，顆粒粗，流速大,部分收集器,部分收集器,返回,自動餾分收集儀（進口）,再生 重復(fù)使用 流速下降、板結(jié)可反沖，取出漂洗,凝膠床的檢查和維護 使用時間過長、流速過大、柱高過大，流速 控制操作壓：柱進出口液位差 凝膠的保存：0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰,返回,蠕動泵

14、,核酸蛋白檢測儀,返回,記錄儀,返回,國產(chǎn)柱層析系統(tǒng),伯樂公司（BIO-RAD）柱層析系統(tǒng),注意事項 1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損。 2）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免壓緊凝膠。 3）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動。,應(yīng)用,生物大分子溶液的脫鹽 用 大粒度、高交聯(lián)度凝膠 使蛋白Kd=0，鹽類Kd=1 蛋白脫鹽后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀鹽（易揮發(fā)鹽）洗脫，真空干燥 樣品體積Vi/3,去熱原 Sephadex G-25 氨基酸 Kd=1 熱原Kd=0 樣品體積 30%Vt,分離純化,GFC

15、可用于相對分子質(zhì)量從幾百到106 數(shù)量級的物質(zhì)的分離純化。 G-50除去結(jié)晶胰島素中前胰島素、大分子抗原 G-25除去青霉素中抗原性雜質(zhì)、致敏、高分子雜質(zhì),右圖是一例利 用高效GFC分離骨髓 血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。,色譜柱： 10300，Superose 6 洗脫液：0.05molL磷酸鹽 0.15molL NaCl（pH7.0） 流量：0.2mlmin 1.IgA高聚體 2. IgA二聚體 3.IgA單體 4.IgG 5.白蛋白,相對分子質(zhì)量的測定,在凝膠過濾介質(zhì)的分級范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)（或洗脫體積）與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成正比，所以GFC可用于未知物質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定。 GFC僅對球形分子的測量精度較高，對分子形狀為棒狀的物質(zhì)，測量值將小于實際值。,理化性質(zhì)鑒定,已知分子量的標準品,測未知分子量：將樣品在同一凝膠柱上，同一條 件下層析、洗脫、測保留體積，并查出分子量。 此法簡便、樣品用量少，有一定的實用價值。,凝膠柱,洗脫體積,分子量的對數(shù),2.理化性質(zhì)鑒定,繪制標準曲線,凝膠層析技術(shù)進行測定,主要參數(shù)測算 Vo通常占柱床30% Vo、Vi 1. 重量法 Vt=Vo+Vi+Vg=d2h/4 Vi=gWr g-干膠重量 Wr-吸液量/ g干膠 Vo=Vt-(Vi+Vg) Vg估算為13/g干膠 2. 過柱法 Ve=Vo