1、,第十章 沉淀反應(yīng)與凝集反應(yīng),第一部分 凝集反應(yīng) 第二部分沉淀反應(yīng),第一部分 凝集反應(yīng),第一節(jié) 凝集反應(yīng)的特點 第二節(jié) 直接凝集反應(yīng) 第三節(jié) 間接凝集反應(yīng) 第四節(jié) 自身紅細(xì)胞凝集試驗 第五節(jié) 抗球蛋白試驗,一、凝集反應(yīng)定義 細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或細(xì)胞性抗原等顆粒性抗原，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，它們與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。參與凝集反應(yīng)的抗體有IgM和IgG,IgM的凝集作用比IgG大數(shù)百倍。,第一節(jié) 凝集反應(yīng)的特點,二、反應(yīng)階段 抗原抗體的特異性結(jié)合 出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象 三、特點 該方法簡便、敏感度高，應(yīng)用廣泛

2、。 四、類型 按抗原的性質(zhì)和反應(yīng)方式的不同分為： 直接凝集和間接凝集,直接凝集反應(yīng)(direct agglutination)： 顆粒性抗原直接與抗體結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。,第二節(jié) 直接凝集反應(yīng),（一） 玻片凝集試驗,（二） 試管凝集試驗,（一）玻片凝集試驗,方法評價: 定性試驗，簡便和快速；敏感度低。 臨床應(yīng)用: 菌種鑒定；血清學(xué)分型；血型鑒定。,在試管內(nèi)顆粒性抗原直接與抗體結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。,（二）試管凝集試驗,方法評價： 半定量試驗；簡便、快速；敏感度低；可有假陽性。 應(yīng)用： 測定相應(yīng)抗體的效價；可作臨床診斷或流行病學(xué)調(diào)查。,試管凝

3、集試驗,根據(jù)凝集程度記錄為：（100凝集）、（75凝集）、（50凝集）、（25凝集）。以出現(xiàn)50凝集以上的血清最大稀釋度為該血清的凝集效價。,間接凝集反應(yīng)(indirect agglutination): 將可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。,第三節(jié) 間接凝集反應(yīng),1.正向間接凝集試驗 2.反向間接凝集試驗 3.間接凝集抑制試驗 4.協(xié)同凝集試驗,一、間接凝集反應(yīng)的類型,用抗原致敏載體-檢測抗體,1.正向間接凝集試驗,2.反向間接凝集試驗,用抗體致敏載體-檢測抗原,3.間接凝集抑制試驗,用抗原致敏載體-檢測抗原,4.協(xié)同

4、凝集試驗,協(xié)同凝集反應(yīng)與間接凝集反應(yīng)的原理相類似，但所用載體既非天然的紅細(xì)胞，也非人工合成的聚合物顆粒，而是一種金黃色葡萄球菌。它的菌體細(xì)胞壁中含有A蛋白SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性，因此當(dāng)這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體。如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)。協(xié)同凝集反應(yīng)也適用于細(xì)菌的直接檢測。,二、間接血凝試驗,反向間接血凝試驗,血凝試驗強度,三、膠乳凝集試驗,孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。 反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不能消耗掉抗HCG抗體。,將待檢血清或抗原和致敏乳膠各滴一滴在玻片上，陽性者510min即出現(xiàn)凝集。如妊娠免疫診

5、：,四、明膠凝集試驗,將病毒抗原或重組抗原吸附于粉紅色明膠顆粒上，當(dāng)致敏顆粒與樣品血清作用時，若血清含有抗病毒抗體則可形成肉眼可見的粉紅色凝集。,五、間接凝集反應(yīng)的應(yīng)用,一）抗原的檢測 反向間接凝集試驗可用于檢測病原體的可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質(zhì)成分。 二）抗體的檢測 檢測細(xì)菌、病毒、寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體。,未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細(xì)胞 試劑：抗人O型紅細(xì)胞的單克隆抗體 臨床應(yīng)用：HIV檢測、HBV檢測,第四節(jié) 自身紅細(xì)胞凝集試驗,自身紅細(xì)胞凝集試驗,抗球蛋白試驗又稱 Coombs試驗,第五節(jié) 抗球蛋白試驗,（一）直接Coombs試驗,檢測紅細(xì)胞上抗體或不完全抗體,單價抗體只能與一方

6、抗原的抗原決定簇結(jié)合，不產(chǎn)生凝集反應(yīng)，當(dāng)加入抗球蛋白抗體后，可以將兩個各連接一方抗原決定簇的單價抗體連接起來，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。,（二）間接Coombs試驗,檢測血清中的抗紅細(xì)胞抗體,臨床應(yīng)用： 在輸血上的應(yīng)用； 血型抗原抗體的檢查； 對新生兒溶血性貧血性疾病的診斷； 對溶血性貧血的研究； 對細(xì)菌或立克次體的不完全抗體檢查。,第一節(jié) 沉淀反應(yīng)的特點 第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗 第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗 第四節(jié) 免疫電泳技術(shù),第二部分 沉 淀 反 應(yīng),1.沉淀反應(yīng)（precipitation）: 是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象,其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)相同。,第一節(jié) 沉淀

7、反應(yīng)原理及特點,2.沉淀反應(yīng)分兩個階段,第一階段： 抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見。 第二階段： 形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。,免疫濁度測定 絮狀沉淀試驗,單向擴散試驗 雙向擴散試驗,對流免疫電泳 火箭免疫電泳 免疫電泳 免疫固定電泳,液體內(nèi)沉淀試驗,凝膠內(nèi)沉淀試驗,凝膠免疫電泳技術(shù),3.沉淀反應(yīng)的類型,絮狀沉淀試驗是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。 方法受抗原抗體比例的影響非常明顯 應(yīng)用于測定抗原抗體反應(yīng)的最適比例 三種類型： 抗原稀釋法：抗原最適比例 抗體稀釋法：抗體最適比例 方陣滴定法：抗原抗體最適比例,一、 絮狀沉淀試驗,第二節(jié)液體

8、內(nèi)沉淀試驗,最適比例方陣測定法,二、免疫濁度測定,1.原理,當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器對濁度進行測定從而檢測抗原含量。,2.影響因素,抗原抗體的比例： 反應(yīng)體系中保持抗體過量 抗體的質(zhì)量: 特異性強，效價高，親和力強。 抗原抗體反應(yīng)液的最適PH: 為6.58.5,可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。 常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。,第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗,一、原理,二、方法,1、單向擴

9、散試驗 （平板法）,原理： 抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)?？梢远?。 技術(shù)要點： 將抗體混入0.9%瓊脂糖內(nèi)（50），未凝固前傾注成平板，凝固后打孔（直徑35mm ），孔中加入抗原溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，置濕盒內(nèi)37,2448h 觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。,傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環(huán),單向擴散試驗（平板法）,影響因素： 抗體質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)曲線 ，質(zhì)控血清 結(jié)果與真實含量不符 雙環(huán)現(xiàn)象（不同擴散率抗原性相同的兩個組分）,上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清,2、雙向擴散試驗 （平板法）,原理： 將

10、抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應(yīng)孔中，兩者在凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一 技術(shù)要點： 平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為3mm，孔間距在35 mm之間，在相對的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒371824h 后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。, 應(yīng)用 a.抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計； b.抗原或抗體相對分子量的估計; c.抗原性質(zhì)的分析; d.抗體效價的滴定; e.抗原或抗體純度的鑒定。,優(yōu)點： 1.加快反應(yīng)的速度。 2.提高了靈敏度。 3.增加了分辨率。,抗原抗體反應(yīng) 的高度特異性,電泳技術(shù)的高 分辨率、快速、 微

11、量,第四節(jié)免疫電泳技術(shù),電泳分析 沉淀反應(yīng),原理：雙向擴散 + 電泳 比雙向擴散試驗靈敏度提高816倍,技術(shù)要點：制備1.2%巴比妥 瓊脂凝膠板，在其上成對打 孔，孔徑3mm，孔距6 mm， 于陰極側(cè)孔內(nèi)加待測血清， 陽性側(cè)孔加抗血清，電泳。,一、對流免疫電泳,蛋白質(zhì)抗原常帶較強的負(fù)電荷，在電場中向正極移動,抗體球蛋白 帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動,對流免疫電泳,通電,結(jié)果分析： 無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。 沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。 沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度抗原，反之，則是抗體濃度抗原濃度。,對流免疫電泳,電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的抗原向正極

12、泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。,二、火箭免疫電泳,1.原理：,單向免疫擴散電泳，定量檢測技術(shù),2. 技術(shù)要點： 1.2%巴比妥瓊脂糖約55，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)， 6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測樣品濃度。 3. 影響因素： 瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則; 電泳終點時間的確定;標(biāo)本數(shù)量多時應(yīng)先通電后加樣,防止寬底峰形; IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結(jié)合（甲?；?，抵消了電滲作用。,三、免疫電泳,一）原理： 區(qū)帶電泳雙向擴散。 1、蛋白質(zhì)抗原在電場中，由于遷移率（取決于其分子量的大小和所帶凈電荷的多少）不同，其泳動速度不同，將復(fù)合蛋白質(zhì)在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶。 2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進行雙向擴散 。,二）技術(shù)要點： 制備瓊脂板，打孔，加樣于孔內(nèi)，電泳23mA/