1、Chapter three Techniques of genetic engineering,Analysis of DNA sequence,Section four,一. 化學(xué)法(Chemical sequencing),1977年Maxam 和Gilbert建立，是唯一能直接應(yīng)用于雙鏈DNA測序的方法。 用此法測定SV40 為5226 bp,1. 原理：,用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA片斷，造成堿基A，T，G，C處的特異性切割。由此產(chǎn)生的一組具有不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影之后，便可根據(jù)x光底片上所顯示的相應(yīng)譜帶，直接讀出待測DNA片斷的核苷酸

2、序列。,2. 化學(xué)切割反應(yīng)的試劑與方法：,肼（hydrazine）：又叫聯(lián)氨（NH2.NH2）， T+C反應(yīng)：在堿性條件下，與胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（ C ）作用。再通過六氫吡啶的作用，使兩個磷酸分子從糖片斷上釋放出來，從而導(dǎo)致在核苷酸位置上發(fā)生DNA的斷裂。 C反應(yīng)：鹽存在的條件下，聯(lián)氨同胸腺嘧啶（T）的反應(yīng)便會被抑制，最終只發(fā)生胞嘧啶（ C ）堿基特異的切割反應(yīng)。 由此來區(qū)別C和C+T這兩種化學(xué)反應(yīng)。,硫酸二甲酯（dimethylsulphate）： G反應(yīng)：硫酸二甲酯能使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，pH中性條件下，從脫氧核糖上移去2個磷酸分子，使DNA鏈在甲基化的鳥嘌呤G位點斷裂。 GA反

3、應(yīng)：酸性條件下，如甲酸處理，可使G和A嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，糖苷鍵穩(wěn)定性下降，利用六氫吡啶（哌啶）使嘌呤堿基脫落，DNA從G和A處斷裂。 由此來區(qū)別G和G+A這兩種化學(xué)反應(yīng)。,二、 Sanger雙脫氧鏈終止法,雙脫氧鏈終止法要求使用一種單鏈的DNA模板和一種適當(dāng)?shù)腄NA合成引物。利用DNA聚合酶的兩種酶催化反應(yīng)的特性： 第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA為模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈； 第二，DNA聚合酶能夠利用2，3-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3-末端，從而終止DNA鏈的延長。,DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP(dAT

4、P、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補(bǔ)DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，因為它與普通dNTP不同，在脫氧核糖的3位置缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。例如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP(其中一種為-32P標(biāo)記)的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5-引物端和以ddC殘基為3端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。,經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來。采用類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3端結(jié)尾的三組長短不一的片段。將制得的四組混合物全部平行地點加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。,dNTP/ddNTP=1:100，,Sanger雙脫氧-pUC體系 pUC是一種質(zhì)粒載體，利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法。,四色熒光法測序： 用四中顏色的熒光標(biāo)記物分別標(biāo)記四個反