1、質(zhì)粒DNA的提取和鑒定,實(shí)驗(yàn)一,一、目的與要求,1.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法及原理 2.了解用分光光度計(jì)測定DNA含量的方法 3.了解“過柱”快提質(zhì)粒DNA,二、 相關(guān)知識(shí)及原理,質(zhì)粒(Plasmid) ： 獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。 存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。,質(zhì)粒（plasmid）,是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 常常編碼一些對宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等,質(zhì)粒

2、的復(fù)制： 嚴(yán)緊型復(fù)制（1n個(gè)） 松弛型復(fù)制（20個(gè)以上）,細(xì)菌質(zhì)粒: 細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從1Kb-200Kb，它們復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組DNA的同一組酶系。,DNA超螺旋結(jié)構(gòu),常用的質(zhì)粒載體,是通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18, pUC19,嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝； 松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過

3、氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。,質(zhì)粒類型：,質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 載體(Vector)： 用于攜帶重組DNA，并且能夠使外源DNA一起復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒(運(yùn)載工具)。,載體具備的條件： 合適的容量 在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制； 易于鑒定； 易于篩選； 易于制備； 易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。,啟始復(fù)制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位點(diǎn)(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 標(biāo)記基因(Marker gene, such as

4、 LacZ gene)。 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene),載體的結(jié)構(gòu)：,三、實(shí)驗(yàn)原理,堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們，在堿性PH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。 堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作原因提取的

5、質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。,堿裂解法,基本原理： 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來,DNA 是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。 SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。,實(shí)驗(yàn)原理：,實(shí)驗(yàn)過

6、程 1.利用變性后狀態(tài)不同：在 pH 12.012.6 堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體 DNA 變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA 雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。 2.利用溶解度的不同：將 pH 調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白質(zhì)在去污劑 SDS 的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒 DNA 仍然為可溶狀態(tài)。 3.利用離心力的不同：通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體 DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中， 4.利用酚變性結(jié)果不同：然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA 。,釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性（NaOH）環(huán)境，就會(huì)變性。然后，

7、用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。 通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。,細(xì)菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。,提純的思路,質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA 要去除的物質(zhì)： 蛋白 基因組DNA 脂類及小分子雜質(zhì) RNA 所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟： 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增； 收集和裂解細(xì)菌； 分離質(zhì)粒DNA( 有

8、時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA),質(zhì)粒DNA的提取方法,方法： 堿裂解法； 煮沸裂解； 羥基磷灰石柱層析法， 質(zhì)粒DNA釋放法； 酸酚法等。 概括起來主要是用非離子型或離子型去污 劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理,選擇哪種方法主要取決于以下幾個(gè)因素： 質(zhì)粒的大小、 大腸桿菌菌株、 裂解后用于純化的技術(shù) 實(shí)驗(yàn)要求,四、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑,（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、 臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋 （二）材料：含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌、 LB液體培養(yǎng)基，氨芐青霉素 （三）試劑： 溶液I作用： 分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活 溶液II作用： 細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。 溶液III

9、作用： 酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白SDS線性 DNA沉淀，K可中和DNA,平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1） 作用： 氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）。 注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。 無水乙醇： 除去DNA水化層，使DNA沉淀 TE緩沖液： 溶解DNA,五、實(shí)驗(yàn)步驟 （一） 細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增,1. 挑單克隆E.coli菌株接種到斜面培養(yǎng)基上 （活化菌種），37過夜培養(yǎng) 2. 從斜面培養(yǎng)基上挑E.coli菌株，接種于25毫升 液體培養(yǎng)液內(nèi)（含氨

10、芐青霉素），37振蕩， 250 r/min 過夜培養(yǎng)。 3. 從中取4毫升種子菌液于含 LB 培養(yǎng)基中（含 Ap），37振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)（OD6001.0）。,（二）質(zhì)粒提取,取1.5ml培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4，30sec。 吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥 將細(xì)菌沉淀懸浮于100l預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。,4.加200L溶液II（新鮮配制），蓋緊Eppendorf 管，快速顛倒5次，混勻內(nèi)容物，將 Eppendorf 管放在冰上。 5.加入150L溶液III（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置5min 6.12 000r/min，離心5mi

11、n，將上清夜轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中 。,7. 向上清夜加入2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置5-10min。12000r/min離心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。 8. 用1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清夜，真空抽干或空氣中干燥。 9. 50L TE緩沖液，使DNA完全溶解（-20保存）。,用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液II 和III后，一定不要?jiǎng)×艺袷帲悦馇兴镈NA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)！,（三）實(shí)驗(yàn)步驟流程,接含pUC18(或pET21a)質(zhì)粒的單菌落于3ml LB Amp+液體培養(yǎng)基中

12、 370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過夜 取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、離心2min，棄上清，收集菌體 100L溶液I懸浮菌體（充分振蕩），室溫（或冰?。?0min 加入200L溶液II（輕輕混勻），冰上靜置5min裂解菌體, 加入150L溶液III（輕輕混勻），冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復(fù)性 12000r/min，離心15min，取上清記錄體積到一新管 上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇（振蕩混勻） 12 000r/min，離心15min，取上清記錄體積到一新管 （可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻） 12000r/min，離心15min，取上清記錄體積到一新管 上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴 30min ,12 000r/min，離心15min 沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（振蕩混勻、離心） 12 000r/min，離心10min 沉淀超凈臺(tái)中風(fēng)干 沉淀用 20l RTE溶解，-2