1、生物化學(xué)與分子生物學(xué),第二章核酸的結(jié)構(gòu)和功能,Structure and Function of Nucleic Acid,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。,1868年 Fridrich Miescher 從膿細(xì)胞中提取核素。 1944年 Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。 1953年 Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 1968年 Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼。 1975年 Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA測(cè)序方法。 1985年 Mullis發(fā)明PC

2、R技術(shù)。 1990年 美國(guó)啟動(dòng)人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)。 1994年 中國(guó)人類(lèi)基因組計(jì)劃啟動(dòng)。 2001年 美英等國(guó)完成人類(lèi)基因組計(jì)劃。,核酸研究的發(fā)展簡(jiǎn)史,核酸的分類(lèi)及分布,存在于細(xì)胞核和線(xiàn)粒體,分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體,(deoxyribonucleic acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脫氧核糖核酸,核糖核酸,第一節(jié) 核酸的化學(xué)組成以及一級(jí)結(jié)構(gòu)The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid,核酸組成,DNA的組成單位是脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）

3、RNA的組成單位是核糖核苷酸（ribonucleotide）。,一、核苷酸是構(gòu)成核酸的基本組成單位,堿基(base)是含氮的雜環(huán)化合物。,堿基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤,鳥(niǎo)嘌呤,尿嘧啶,胸腺嘧啶,胞嘧啶,存在于DNA和RNA中,僅存在于RNA中,僅存在于DNA中,堿基,嘌呤(purine，Pu),腺嘌呤(adenine, A),鳥(niǎo)嘌呤(guanine, G),嘧啶(pyrimidine，Py),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),堿基的互變異構(gòu)體,戊糖,脫氧核苷,嘌呤N-9 與脫氧核糖C-1通過(guò)-N-糖苷鍵相連形成脫氧核苷(deoxyri

4、bonucleoside)。,嘧啶N-1與核糖C-1通過(guò)-N-糖苷鍵相連形成核苷(ribonucleoside)。,核苷,N,N,N,N,9,N,H,2,O,O,H,O,H,H,H,H,C,H,2,O,H,H,1,2,糖苷鍵,核苷或脫氧核苷與磷酸通過(guò)酯鍵結(jié)合構(gòu)成核苷酸(ribonucleotide)或脫氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。,核苷酸(ribonucleotide),多磷酸核苷酸,環(huán)化核苷酸：cAMP、cGMP，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的第二信使。,cAMP,核苷酸衍生物,生物氧化體系的重要成分，在傳遞質(zhì)子或電子的過(guò)程中具有重要的作用。,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotin

5、amide adenine dinucleotide, NAD+），,構(gòu)成RNA的堿基、核苷以及核苷酸,構(gòu)成DNA的堿基、核苷、核苷酸,二、DNA是脫氧核苷酸通過(guò)3,5-磷酸二酯鍵連接形成的大分子,一個(gè)脫氧核苷酸3的羥基與另一個(gè)核苷酸5的-磷酸基團(tuán)縮合形成磷酸二酯鍵(phosphodiester bond)。 多個(gè)脫氧核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵構(gòu)成了具有方向性的線(xiàn)性分子，稱(chēng)為多聚脫氧核苷酸(polydeoxynucleotide)，即DNA鏈。,C,G,A,交替的磷酸基團(tuán)和戊糖構(gòu)成了DNA的骨架 (backbone)。,DNA鏈的方向是5 3,三、RNA也是具有3, 5-磷酸二酯鍵的線(xiàn)性大分子,RN

6、A也是多個(gè)核苷酸分子通過(guò)3,5-磷酸二酯鍵連接形成的線(xiàn)性大分子，也具有53方向性; RNA的戊糖是核糖； RNA的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。 構(gòu)成RNA的四種基本核苷酸是AMP、GMP、CMP和UMP。,定義 核酸中核苷酸的排列順序。 由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱(chēng)為堿基序列。,四、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)是核苷酸的排列順序,核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,A C T G C T,單鏈DNA和RNA分子的大小常用核苷酸數(shù)目（nucleotide，nt）表示；雙鏈核酸分子的大小常用堿基(base或kilobase)數(shù)目來(lái)表示。 小的核酸片段(

7、50bp)常被稱(chēng)為寡核苷酸(oligonucleotide)。自然界中的DNA和RNA的長(zhǎng)度可以高達(dá)幾十萬(wàn)個(gè)堿基。,第二節(jié) DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能Dimensional Structure and Function of DNA,DNA的空間結(jié)構(gòu)又分為二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure)和高級(jí)結(jié)構(gòu)。,DNA的空間結(jié)構(gòu)(spatial structure),構(gòu)成DNA的所有原子在三維空間的相對(duì)位置關(guān)系。,一、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu),不同生物種屬的DNA的堿基組成不同 同一個(gè)體的不同器官或組織的DNA堿基組成相同 對(duì)于一特定組織的DNA，其堿基組分不隨年齡、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境而變化

8、 A = T，G = C,Chargaff 規(guī)則,（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),獲得了高質(zhì)量的DNA分子的X射線(xiàn)衍射照片。,提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)(double helix)模型。,兩條多聚核苷酸鏈在空間的走向呈反向平行(anti-parallel)。兩條鏈中一條鏈的53方向是自上而下，而另一條鏈的53方向是自下而上。 兩條鏈圍繞著同一個(gè)螺旋軸形成右手螺旋(right-handed)的結(jié)構(gòu)。 雙螺旋結(jié)構(gòu)的直徑為2.37nm，螺距為3.54nm。,（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn),1.DNA由兩條多聚脫氧核苷酸鏈組成,脫氧核糖和磷酸基團(tuán)組成的親水性骨架位于雙螺旋結(jié)構(gòu)的外側(cè)，疏水的堿基位于

9、內(nèi)側(cè)。 雙螺旋結(jié)構(gòu)的表面形成了一個(gè)大溝(major groove)和一個(gè)小溝(minor groove)。,2. 核糖與磷酸位于外側(cè),DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的示意圖,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的俯視圖,3. DNA雙鏈之間形成了互補(bǔ)堿基對(duì),堿基配對(duì)關(guān)系稱(chēng)為互補(bǔ)堿基對(duì)(complementary base pair)。 DNA的兩條鏈則互為互補(bǔ)鏈(complementary strand)。 堿基對(duì)平面與螺旋軸垂直。,堿基互補(bǔ)配對(duì): 鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶,堿基互補(bǔ)配對(duì): 腺嘌呤/胸腺嘧啶,大溝與小溝,相鄰兩個(gè)堿基對(duì)會(huì)有重疊，產(chǎn)生了疏水性的堿基堆積力(base stacking interaction)。 堿基堆積力和

10、互補(bǔ)堿基對(duì)的氫鍵共同維系著DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。,4. 堿基對(duì)的疏水作用力和氫鍵共同維持著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,堿基堆積作用力,（三）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性,（四）DNA的多鏈結(jié)構(gòu),在酸性的溶液中，胞嘧啶的N-3原子被質(zhì)子化，可與鳥(niǎo)嘌呤的N-7原子形成氫鍵；同時(shí)，胞嘧啶的N-4的氫原子也可與鳥(niǎo)嘌呤的O-6形成氫鍵，這種氫鍵被稱(chēng)為Hoogsteen氫鍵。,Hoogsteen氫鍵,Hoogsteen氫鍵，不破壞Watson-Crick氫鍵，由此形成了CGC的三鏈結(jié)構(gòu)(triplex)。,三鏈結(jié)構(gòu),鳥(niǎo)嘌呤之間通過(guò)8個(gè)Hoogsteen氫鍵形成特殊的四鏈結(jié)構(gòu)(tetraplex)。,四鏈結(jié)構(gòu),真核生物

11、DNA3-末端是富含GT的多次重復(fù)序列，因而自身形成了折疊的四鏈結(jié)構(gòu)。,二、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是超螺旋結(jié)構(gòu),超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix 或supercoil) DNA雙螺旋鏈再盤(pán)繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。,正超螺旋(positive supercoil) 盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方同相同。,負(fù)超螺旋(negative supercoil) 盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方向相反。,（一）原核生物DNA的環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu),原核生物DNA多為環(huán)狀的雙螺旋分子 ，以負(fù)超螺旋的形式存在，平均每200堿基就有一個(gè)超螺旋形成。,（二）真核生物DNA以核小體為單位形成高度有序致密結(jié)構(gòu),真核生物DNA以非常有序的形式存在于

12、細(xì)胞核內(nèi)。 在細(xì)胞周期的大部分時(shí)間里，DNA以松散的染色質(zhì)(chromatin)形式存在，在細(xì)胞分裂期，則形成高度致密的染色體(chromosome)。,DNA染色質(zhì)呈現(xiàn)出的串珠樣結(jié)構(gòu)。 染色質(zhì)的基本單位是核小體(nucleosome)。,DNA染色質(zhì)的電鏡圖像,DNA：約200bp 組蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,核小體的組成,核小體串珠樣的結(jié)構(gòu),雙鏈DNA的折疊和組裝,DNA經(jīng)過(guò)多次折疊，被壓縮了800010000倍，組裝在直徑只有數(shù)微米的細(xì)胞核內(nèi)。,真核生物的染色體,兩個(gè)功能區(qū)：,端粒(telomeres):染色體末端膨大的粒狀結(jié)構(gòu)，由染色體末端DNA（端粒DNA）與DNA結(jié)合

13、蛋白構(gòu)成。與染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、完整性以及衰老和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 著絲粒（centromere）:兩個(gè)染色單體的連接位點(diǎn)，富含A、T序列。細(xì)胞分裂時(shí)，著絲?？煞珠_(kāi)使染色體均等有序地進(jìn)入子代細(xì)胞。,DNA是生物遺傳信息的載體，并為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄提供了模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。 基因是攜帶遺傳信息的DNA片段，它們的序列信息意義及其在DNA整個(gè)分子上的排布特點(diǎn)將在第十三章詳述。 DNA具有高度穩(wěn)定性的特點(diǎn)，用來(lái)保持生物體系遺傳的相對(duì)穩(wěn)定性。同時(shí)，DNA又表現(xiàn)出高度復(fù)雜性的特點(diǎn)，它可以發(fā)生各種重組和突變，適應(yīng)環(huán)境的變遷，為自然選擇提供機(jī)會(huì)。,三、DNA是遺傳信息的

14、物質(zhì)基礎(chǔ),第三節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能,Structure and Function of RNA,RNA與蛋白質(zhì)共同負(fù)責(zé)基因的表達(dá)和表達(dá)過(guò)程的調(diào)控。 RNA通常以單鏈的形式存在，但有復(fù)雜的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。 RNA比DNA小的多。 RNA的種類(lèi)、大小和結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比DNA表現(xiàn)出多樣性。,動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要的RNA種類(lèi)及功能,信使RNA(messenger RNA, mRNA)是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的模板。 生物體內(nèi)mRNA的豐度最小、種類(lèi)最多、大小也各不相同、壽命最短。 mRNA的初級(jí)產(chǎn)物為不均一核RNA(hnRNA)，含有內(nèi)含子(intron)和外顯子(exon)。 hnRNA經(jīng)過(guò)剪切后成為成熟的m

15、RNA。,一、mRNA是蛋白質(zhì)合成中的模板,內(nèi)含子 (intron),mRNA成熟過(guò)程,外顯子 (exon),成熟的mRNA由氨基酸編碼區(qū)和非編碼區(qū)構(gòu)成。 5-末端的帽子(cap)結(jié)構(gòu)和3-末端的多聚A尾(poly-A tail)結(jié)構(gòu)。,成熟的真核生物mRNA,帽子結(jié)構(gòu):m7GpppNm,1. 真核生物mRNA的5-端有特殊帽結(jié)構(gòu),mRNA的帽結(jié)構(gòu)可以與帽結(jié)合蛋白(cap binding protein，CBP)結(jié)合。,真核生物的mRNA 的3-末端轉(zhuǎn)錄后加上一段長(zhǎng)短不一的聚腺苷酸。,2. 真核生物mRNA的3末端有多聚腺苷酸尾,mRNA的多聚A尾在細(xì)胞內(nèi)與poly(A)結(jié)合蛋白（poly(A

16、)-binding protein，PABP）結(jié)合存在。,mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位 mRNA的穩(wěn)定性維系 翻譯起始的調(diào)控,帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能,3. mRNA堿基序列決定蛋白質(zhì)的氨基酸序列,從mRNA分子5末端起的第一個(gè)AUG開(kāi)始，每3個(gè)核苷酸為一組稱(chēng)為密碼子(codon) 。,位于起始密碼子和終止密碼子之間的核苷酸序列稱(chēng)為開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)，決定了多肽鏈的氨基酸序列 。,在mRNA的開(kāi)放讀框的兩側(cè)，為非翻譯序列（untranslated region，UTR），即5-UTR和3-UTR。,轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA, tRNA)在蛋白質(zhì)

17、合成過(guò)程中作為各種氨基酸的載體, 將氨基酸轉(zhuǎn)呈給mRNA。 由7495核苷酸組成； 占細(xì)胞總RNA的15%； 具有很好的穩(wěn)定性。,二、tRNA是蛋白質(zhì)合成中的氨基酸載體,1. tRNA中含有多種稀有堿基,稀有堿基（rare base）是指除A、G、C、U外的一些堿基。,tRNA具有局部的莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)或發(fā)卡(hairpin)結(jié)構(gòu)。,2. tRNA含有莖環(huán)結(jié)構(gòu),tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 三葉草形,氨基酸臂， DHU環(huán)， 反密碼環(huán)， TC環(huán)， 附加叉,tRNA的倒L三級(jí)結(jié)構(gòu),tRNA的3-末端為CCA結(jié)尾。 3-末端的A與氨基酸以酯鍵相連生成氨基酰-tRNA 。 不同的tRNA結(jié)合不同的

18、氨基酸。,3. tRNA的3-末端連接氨基酸,tRNA的反密碼子環(huán)上有反密碼子(anticodon)。 tRNA上的反密碼子通過(guò)堿基互補(bǔ)識(shí)別mRNA上的密碼子。,4. tRNA的反密碼子識(shí)別mRNA的密碼子,核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)是細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA(80)。 rRNA與核糖體蛋白結(jié)合組成核糖體(ribosome)，為蛋白質(zhì)的合成提供場(chǎng)所。,三、以rRNA為組分的核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所,核糖體的組成,大腸桿菌的核蛋白體,18S rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),四、其他非編碼RNA參與基因表達(dá)的調(diào)控,長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA

19、）,非編碼RNA（ Non-coding RNA, ncRNA）,不編碼蛋白質(zhì)但具有重要生物學(xué)功能的RNA分子。,短鏈（小）非編碼RNA（small non-coding RNA, sncRNA）,ncRNA 功能,參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA的剪切和修飾、mRNA的穩(wěn)定和翻譯調(diào)控、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)、染色體的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等細(xì)胞重要功能,lncRNA 功能,lncRNA在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于mRNA，但序列中不存在開(kāi)放讀框。許多已知的lncRNAs由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄并經(jīng)可變剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。lncRNA具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，并與一些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。有的lncRNA能使基因沉默，有的則激活

20、基因的表達(dá)。,核內(nèi)小RNA 核仁小RNA 胞質(zhì)小RNA 催化性小RNA 小干涉 RNA 微 RNA,短鏈非編碼RNA亦稱(chēng)為非編碼小RNA（small non-messenger RNA）,核內(nèi)小RNA（small nuclear RNA, snRNA）位于細(xì)胞核內(nèi)。snRNA有5種，分別稱(chēng)為U1、U2、U4、U5、U6，它們與多種蛋白形成復(fù)合體，參與真核細(xì)胞hnRNA的內(nèi)含子加工剪接（第十六章）。 核仁小RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）：定位于核仁，主要參與rRNA的加工和修飾，如rRNA中核糖C-2的甲基化修飾。 胞質(zhì)小RNA（small cytoplasmi

21、c RNA, scRNA）：存在于細(xì)胞質(zhì)中，參與形成信號(hào)識(shí)別顆粒，引導(dǎo)含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成（第十七章）。,催化性小RNA亦被稱(chēng)為核酶（ribozyme）。是細(xì)胞內(nèi)具有催化功能的一類(lèi)小分子RNA，具有催化特定RNA降解的活性，在RNA的剪接修飾中具有重要作用。 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）是生物宿主對(duì)于外源侵入基因表達(dá)的雙鏈RNA進(jìn)行切割所產(chǎn)生的具有特定長(zhǎng)度（2123 bp）和特定序列的小片段RNA。這些siRNA可以單鏈形式與外源基因表達(dá)的mRNA相結(jié)合，并誘導(dǎo)相應(yīng)mRNA降解。,微RNA（microRNAs, miRNAs ）,是一類(lèi)

22、長(zhǎng)度為22nt左右的內(nèi)源性sncRNA。miRNAs主要是通過(guò)結(jié)合mRNA而選擇性調(diào)控基因的表達(dá)。,原核生物基因表達(dá)的特異性,五、核酸在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的時(shí)空特性,真核生物基因表達(dá)的特異性,核酸的理化性質(zhì) The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第四節(jié),核酸在波長(zhǎng) 260nm 處有強(qiáng)烈的吸收，是由堿基的共軛雙鍵所決定的。這一特性常用作核酸的定性和定量分析。,一、核酸分子具有強(qiáng)烈的紫外吸收,堿基的紫外吸收光譜,DNA或RNA的定量 A260 = 1.0 相當(dāng)于 50g/ml 雙鏈DNA(dsDNA) 40g/ml 單

23、鏈DNA (ssDNA or RNA) 20g/ml 寡核苷酸 確定樣品中核酸的純度 純 DNA: A260/A280 = 1.8 純 RNA: A260/A280 = 2.0,紫外吸收的應(yīng)用,二、DNA變性是雙鏈解離為單鏈的過(guò)程,某些理化因素導(dǎo)致DNA雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵發(fā)生斷裂，DNA雙鏈解離為單鏈的過(guò)程。,定義,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂。,部分解鏈,雙鏈DNA,DNA的變性,DNA的變性,部分變性DNA的電鏡圖像,增色效應(yīng)(hyperchromic effect)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。,DNA解鏈時(shí)的紫外吸收變化,DNA的解鏈曲線(xiàn),連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度相對(duì)于A260值作圖，所得的曲線(xiàn)稱(chēng)為解鏈曲線(xiàn)。,解鏈過(guò)程中，紫外吸光度的變化達(dá)到最大變化值的一半時(shí)所