1、實驗9生物顯微切片技術，綜合性，12小時，實驗目的和要求，1。了解石蠟切片主要步驟的基本原理。2.掌握各種試劑的制備和各種設備的使用。3.掌握石蠟切片法的具體操作方法。4.熟悉實驗過程中的注意事項。5.用植物和動物材料制備標本切片。6.通過顯微鏡下觀察魚肝細胞染色玻片標本，了解魚肝細胞的顯微結構。生物切片技術綜述。生物顯微切片技術是觀察和研究細胞、組織、胚胎和動物的形態(tài)、結構和病理變化的重要方法。因為生物體的器官和組織太大或太厚，無法在光學顯微鏡下觀察，或者可以放在光學顯微鏡下觀察，所以光不能透過，而且一些精細結構具有相同的折射率，所以即使光可以透過，它們也看不清楚。因此，有必要在顯微術中使用

2、各種方法來制備載玻片樣品，從而可以在光學顯微鏡下觀察組織細胞并長期保存，并且結構對比變得明顯。一般來說，它可以分為切片法和非切片法。切片方法：石蠟切片法；火棉膠切片法；冰凍切片法等。非切片法：包括整體密封法；涂層方法。壓縮法，除了鋪路、研磨等。微觀生產(chǎn)需要經(jīng)過一系列的操作，這些操作相當細致復雜，每一步的失誤都會導致整體的失敗，所以需要耐心細致，動用雙手和大腦。切片法：取樣、固定、洗滌、脫水、透明包埋、染色、脫水和密封。非切片法：樣品經(jīng)固定、清洗、脫水、染色、脫水和透明密封。與非切片法相比，切片法可以顯示組織和細胞的精細結構，對比度非常明顯和清晰。但是，操作步驟多，程序復雜，生產(chǎn)速度慢，耗時長。

3、例如，洋蔥根尖縱切面的線粒體和有絲分裂的觀察；小麥和玉米葉片橫切中木質化細胞質和纖維素細胞質的觀察。切片法是生物顯微鏡中最常用和最重要的方法，其中石蠟切片法最為重要。非切片法可以保持生物體或部分器官和組織的原始狀態(tài)和完整性，但沒有切片程序，它不僅可以清楚地顯示器官和組織之間的關系，還可以顯示組織和細胞之間的結構關系。在非切片方法中，整個切片方法只能切片非常小的材料，例如人口腔上皮和草履蟲。涂片法僅適用于含有大量水分或完全是液體的組織或器官。1、1.1非切片法，1.1涂片法主要用于液體顆粒狀物質如血液、精液、尿液、微生物液體培養(yǎng)物等。它不能用切片法切片，可以作為單層細胞涂在載玻片上，也可以固定、

4、脫水和染色制成永久性標本。1.2鋪展法主要用于觀察動植物組織的表皮。待觀察的動植物組織可從活體中取出，用鋒利的鑷子撕下一層表皮，迅速鋪在載玻片上。如：洋蔥表皮細胞。1.3壓片法將一些柔軟的材料放在載玻片上，用小手術刀分散，加入一滴染料，用蓋玻片覆蓋，用拇指垂直用力擠壓，將組織分散成薄片，然后觀察，如通過按壓植物根尖觀察染色體。1.4磨盤用于硬組織，如骨骼和牙齒。1.5分離過程該方法使用化學試劑溶解間質組織并將組織分散成單個游離細胞。例如，染色體標本是通過植物去壁和低滲的方法制備的。2.切片方法。切片是用光學顯微鏡或電子顯微鏡觀察動植物組織的薄片。切片法是用手或切片機將組織切成薄片來觀察組織的方

5、法。有必要通過一系列步驟將一些支持物質滲透到組織中，以硬化組織進行切片。根據(jù)t2.1石蠟切片法，包括以下主要步驟：取樣、固定、清洗、脫水、透明蠟浸包埋切片、脫鈣、脫水、透明密封等。一般組織從材料固定到密封需要幾天時間才能制成玻片標本，標本切片可以長期保存。每個環(huán)節(jié)、材料的詳細步驟和要求：材料必須新鮮完整，如果儲存時間過長，蛋白質會分解和變性，導致細胞自溶和細菌繁殖，避免擠壓和挫傷，這不能反映體內(nèi)組織的形態(tài)結構。注明采集時間、地點、名稱、組織部位等。組織塊的適宜尺寸為0 . 50 . 50 . 2厘米。固定化：將切好的新鮮材料用化學溶液浸泡成小塊，使細胞和組織中的物質成分快速凝固或沉淀，停止細胞

6、的所有代謝過程，防止細胞自溶或組織變化，并盡可能保持細胞的結構不變。此外，固色還能使組織變硬并有助于染色。此外，還有干燥、高熱和低溫淬火等物理方法。洗滌和脫水：洗滌：固定的薄紙材料需要去除殘留在薄紙中的固定液及其晶體沉淀，以免影響以后的染色效果。用自來水沖洗。脫水：清洗過的紙巾充滿了水，需要在透明、上蠟和嵌入之前去除水分。脫水逐漸用一種既能與水混合又能與透明劑混合的液體代替樣品中的游離水。脫水器通常使用乙醇或丙酮、正丁醇和叔丁醇進行梯度脫水。每次持續(xù)幾個小時。脫水過程：通常從30或50%乙醇開始，一般30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，800%，100%。脫水劑的濃度不應太寬，以免引起組織強烈

7、收縮或變形。透明是用可與脫水劑(乙醇)和包埋介質(石蠟)混溶的液體代替樣品中的脫水劑(乙醇)，從而為最終包埋創(chuàng)造有利條件?，F(xiàn)在使用的透明劑一般是二甲苯、甲苯、氯仿、芳香瀝青等。一般過程如下：1/3二甲苯-2/3乙醇混合物1/2二甲苯-1/2乙醇混合物2/3二甲苯-1/3乙醇混合物二甲苯是使用最廣泛的透明劑，其滲透性強，溶蠟量大，易揮發(fā)，其缺點是容易使組織收縮、變硬、變脆。將透明步驟后的組織塊浸入透明劑和石蠟的混合溶液中，逐漸增加石蠟的比例，直至組織塊中的透明劑完全被石蠟替代，便于后續(xù)的包裹和切片。每個階段應在培養(yǎng)箱(60，液體石蠟)中浸泡蠟1-3小時。包埋后的樣品在石蠟中浸泡后，內(nèi)部空間被石蠟

8、完全占據(jù)，然后需要將其包埋到具有相同硬度的石蠟塊中切片。用鑷子將石蠟浸泡過的組織塊輕輕夾入盛有液體石蠟的紙盒中，放置好，石蠟冷卻至固態(tài)后完成包埋。多個組織可以同時嵌入。此時，組織材料的預處理過程已經(jīng)完成，可以用于切片。切片和修整：切片前，蠟塊應修整。首先，大的蠟塊應該被切割，使每個小塊包含一塊組織，然后修剪成立方體或長方體。組織周圍石蠟的厚度與切面的厚度相等(3毫米)。固定：將修復后的蠟塊粘貼在合適尺寸的樣品臺上(臺木)，以便固定在切片機上。切片：調(diào)整切片機的刀片位置，使其與桌面上的蠟面平行。一只手拿著毛筆，另一只手轉動切片機，切好的蠟塊連接成一條長長的蠟條。將蠟帶按要求切成幾段，放在40的水

9、面上。貼片：蠟帶貼在一個干凈的載玻片上，上面有粘性藥片(蛋白質甘油)。在恒溫載物臺上展平并干燥。對于脫蠟、水合和染色蠟帶，必須用二甲苯除去石蠟，然后用乙醇除去二甲苯，然后在水中染色。染色方法很多，應根據(jù)標本的要求選擇不同的染料。最常見的是蘇木精-伊紅染色核染料核中使用的染料包括天然染料，如蘇木精和品紅，以及合成染料，如藏紅花、節(jié)紫、硫堇、甲苯胺藍、甲基綠、美藍、孔雀石綠和焦油紫。(2)細胞質中使用的細胞質染料包括曙紅、亮綠、橙G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍。(3)脂質染色劑用于顯示脂質的染色劑包括蘇丹紅三號、蘇丹紅四號、尼羅藍硫酸鹽和油紅。該方法包括以下步驟：二甲苯1/2二甲苯1/2乙醇混

10、合物100%乙醇95%乙醇85%乙醇70%乙醇50%乙醇30%乙醇蘇木精染料溶液0.01%鹽酸0.01%氫氧化鈉蒸餾水30%乙醇50%乙醇70%乙醇85%乙醇曙紅染料溶液95%乙醇100%乙醇，3個石蠟切片實例魚肝切片，材料：魚肝(2-3毫米厚，肉3-4小時/包/包/澤尼克固定為試劑：固定液、蘇木精染料溶液、1%曙紅水溶液、1%鹽酸乙醇溶液、氨水、二甲苯、300%乙醇、甘油蛋白粘片和中性膠。蘇木精是一種堿性染料(含有陽離子)，而曙紅是一種酸性染料。魚肝細胞的細胞核含有酸性物質，它能很容易地與堿性染料的陽離子結合而染藍色，而細胞質含有堿性物質，它能很容易地與酸性染料中的陰離子結合而染粉紅色。實驗

11、程序：樣品(2-355 mm3)，固定(卡諾3-4小時，布恩12-24小時)，洗滌(70%乙醇3-5次)，脫水(80%，90%，100%乙醇各0.5小時)，透明(乙醇和二甲苯混合均勻15分鐘，二甲苯混合兩次15分鐘)。石蠟56-60，0.5小時兩次)包埋(凝固30分鐘)切片(8米，涂在水面上)粘貼(粘片，滴1滴)粘貼(40-45)干燥(37，24小時)脫蠟(二甲苯2-5分鐘，二甲苯乙醇2-5分鐘)復水(100%，90%，80%，70%，50%，蒸餾水每2分鐘)染色(杜氏蘇木染料溶液15-20分鐘)水洗(2.5分鐘兩次，共5分鐘)分色)發(fā)藍(氨水3-4秒)、水洗(兩次，每次5分鐘)、再染色(1%

12、曙紅水溶液，每次1-5分鐘)、脫水(50%持續(xù)幾秒鐘、70%、80%、100%乙醇，每次2分鐘)、透明(乙醇二甲苯，每次5分鐘、二甲苯，每次5分鐘)并密封(中性樹膠50)。4植物組織切片技術實例，4.1徒手切片重要的是切下一小塊扁平而薄的組織，而不是完整的組織切片；握住材料或夾子(萵苣莖、胡蘿卜根、泡沫塑料等)。)左手握刀(刀片或手術刀),右手握穩(wěn)，用手臂力量代替手腕力量；刀片平放在展平的平面上，輕輕按壓刀片，勻速平穩(wěn)移動，從刀片的右側向左側傾斜切割，不擠壓材料，不鋸切；水保持在材料的切割表面和切割邊緣，以防止材料變干；切片可簡單染色1-2分鐘，0.1%亞甲藍，0.5%中性紅，1%藏紅花(木質化細胞壁和細胞核染成紅色)I2-KI溶液(淀粉顆粒為藍色，細胞核為黃色)，4.2石蠟切片(根、莖、葉)，顯微鏡觀察，便于器官的三維重建。硬質材料可用作滑動切片機，通常也可用作手動切片機。程序：取材料(0.5-1cm3)，固定(Kano，F(xiàn)AA，2-24小時，如果材料有空氣，需要泵送)，清洗(70%乙醇兩次)，脫水(80%，90%，100%，100%乙醇各0.5小時)，透明(乙醇和二甲苯混合均勻15分鐘，二甲苯混合0.5小時兩次)，通過蠟(0.5)。0.5-1小時兩次)，包埋(凝固30分鐘)，切片(8米，攤在水