1、細(xì)胞生物學(xué)Cell Biology,主講教師：陳原國(guó) 聯(lián)系方式：3785911， 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,第七章真核細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)分選與膜泡運(yùn)輸,細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)(endomembrane system)：真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有的結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)生上相互聯(lián)系的膜圍繞的細(xì)胞器構(gòu)成的區(qū)室化結(jié)構(gòu)(compartmentalization)。主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、胞內(nèi)體和分泌泡等，由膜圍繞的細(xì)胞器或細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞內(nèi)部被膜分為3類(lèi)結(jié)構(gòu)： 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)， 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)(cytoplasmic matrix)、 其它由膜包被的各種細(xì)胞器：線(xiàn)粒體、葉綠體、過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞核。,第七章真核細(xì)胞內(nèi)膜系

2、統(tǒng)、蛋白質(zhì)分選與膜泡運(yùn)輸,第一節(jié)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的涵義與功能 第二節(jié)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)及其功能 第三節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分選與膜泡運(yùn)輸 復(fù)習(xí)題,Membranes divide the cytoplasm of eukaryotic cells into distinct compartments. Three categories compartments in eukaryotic cells: (1) the cytosol. (2) the endomembrane system: ER, Golgi complex, Lys., secretory vesicles. (3) mitochondri

3、a, chloroplasts, peroxisomes, and the nucleus.,第一節(jié)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的涵義與功能,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)(cytoplasmic matrix or cytomatrix)：在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，除去可分辨的細(xì)胞器以外的膠狀物質(zhì)。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)體積約占細(xì)胞質(zhì)的一半。 一.細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的涵義 二.細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的功能,肝細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)及其它組分的數(shù)目及所占體積比,一.細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的涵義,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)完成了細(xì)胞與環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)間物質(zhì)運(yùn)輸、能量交換、信息傳遞等，及很多重要中間代謝反應(yīng)。 曾用名：細(xì)胞液(cell sap)，透明質(zhì)(hyaloplasm)，胞質(zhì)溶膠(cytoso

4、l)等。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的主要成分： 與中間代謝有關(guān)的數(shù)千種酶類(lèi) 維持細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的細(xì)胞質(zhì)骨架結(jié)構(gòu) 對(duì)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)認(rèn)識(shí)：從酶溶液，到高度的組織體系。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)研究困難的主要原因： 細(xì)胞破裂，甚至在稀釋溶液中，通過(guò)弱鍵互作處于動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)構(gòu)體系就會(huì)遭到破壞。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與胞質(zhì)溶膠的比較(實(shí)驗(yàn)證明) 對(duì)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的兩種研究觀(guān)點(diǎn),胞質(zhì)溶膠與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)： 胞質(zhì)溶膠(cytosol)：用差速離心的方法分離細(xì)胞勻漿物中的各種細(xì)胞組分，先后除去細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、溶酶體、高爾基體和細(xì)胞質(zhì)膜等細(xì)胞器或細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，存留在上清液中的成分，主要是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的成分。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)(cytoplasmic matr

5、ix or cytomatrix) ：細(xì)胞內(nèi)形成的粘稠膠體，蛋白質(zhì)含量約占2030，多數(shù)水分子以水化物形式緊密地與蛋白質(zhì)和其它大分子表面極性部位結(jié)合，僅部分水分子游離態(tài)存在，起溶劑作用。眾多蛋白在細(xì)胞骨架和游離水分子間形成凝聚和溶解的動(dòng)態(tài)平衡。 即細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中多數(shù)蛋白質(zhì)，多不是以溶解狀態(tài)存在。 胞質(zhì)溶膠與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)溶液成分比較實(shí)驗(yàn),胞質(zhì)溶膠與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)溶液成分比較：乳膠小球?qū)嶒?yàn) Paine將乳膠小球用顯微注射方法注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞，一段時(shí)間后取出乳膠小球，聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳分析滲入小球中的蛋白質(zhì)。 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)80%多肽未擴(kuò)散到乳膠小球中。 說(shuō)明結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的蛋白不容易滲入乳膠小

6、球。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)高度組織性的實(shí)驗(yàn)證明： 用免疫熒光技術(shù)顯示了與糖酵解過(guò)程有關(guān)的一些酶結(jié)合在微絲上，在骨骼肌細(xì)胞中則結(jié)合在肌原纖維的某些特殊位點(diǎn)上。,1.一些學(xué)者：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)主要是由微管、微絲和中間絲等形成的相互聯(lián)系的結(jié)構(gòu)體系。 即細(xì)胞質(zhì)骨架貫穿細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中多數(shù)的蛋白質(zhì)直接或間接地與骨架結(jié)合，或與生物膜結(jié)合，從而完成特定的生物學(xué)功能。 2.另一些學(xué)者，將細(xì)胞質(zhì)骨架排出在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)概念之外。,二.細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的功能：擔(dān)負(fù)一系列重要的功能。,1.進(jìn)行許多物質(zhì)中間代謝過(guò)程。 如糖酵解過(guò)程，磷酸戊糖途徑，糖醛酸途徑，糖原、蛋白質(zhì)、脂肪酸的合成，部分生物大分子分解等。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，底物和產(chǎn)物

7、定向轉(zhuǎn)運(yùn)等機(jī)制了解有限。 2.多種信號(hào)通路在細(xì)胞質(zhì)中形成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及對(duì)話(huà)。第八章 3.蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的分選及轉(zhuǎn)運(yùn)。第六、七章 根據(jù)蛋白自身所帶信號(hào)運(yùn)送到線(xiàn)粒體、葉綠體、過(guò)氧化物酶體(微體)、細(xì)胞核，或定于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。 4.細(xì)胞質(zhì)骨架的功能：維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、能量傳遞、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中細(xì)胞器和其它成分的錨定等。完成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的三維定位。第九章 5.對(duì)蛋白質(zhì)修飾、選擇性降解、正確折疊等作用。,“Road map” of protein traffic,1. Gated 2. Transmembrane Vesicular 基質(zhì)中蛋白轉(zhuǎn)運(yùn),Summary0f proteinsyn

8、thesisand transport,*Gated transport *Transmembrane transport *Vesicular transport,*,*,*,*,*,Cotranslational translocation,Posttranslation translocation,5.細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)修飾、選擇性降解、正確折疊等方面的作用。 （1）蛋白質(zhì)的修飾 （2）控制蛋白質(zhì)的壽命 （3）降解變性和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì) （4）幫助變形或錯(cuò)誤折疊的蛋白重新折疊，形成正確的分子構(gòu)象。,（1）蛋白質(zhì)的修飾 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)生的主要蛋白質(zhì)修飾類(lèi)型： 輔酶或輔基與酶的共價(jià)結(jié)合。 磷

9、酸化與去磷酸化，以調(diào)節(jié)很多蛋白質(zhì)生物活性。 糖基化。哺乳動(dòng)物，N-乙酰葡萄糖胺(Nacetyl-glucosamine)加到蛋白質(zhì)中Ser羥基。 甲基化。細(xì)胞骨架蛋白和組蛋白等蛋白質(zhì)N-端甲基化，以維持其較長(zhǎng)壽命，不易被蛋白酶水解。 酰基化修飾。 最常見(jiàn)一類(lèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，把軟脂酸鏈共價(jià)地連接在跨膜蛋白的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)側(cè)的結(jié)構(gòu)域。 另一類(lèi)發(fā)生在諸如src和ras癌基因產(chǎn)物上，將脂肪酸鏈共價(jià)地結(jié)合到蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)。如src基因編碼的酪氨酸蛋白激酶，與豆蔻酸共價(jià)結(jié)合，才能轉(zhuǎn)移并靠豆蔻酸鏈結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)膜上，完成細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 ,（2）控制蛋白質(zhì)壽命：細(xì)胞質(zhì)蛋白大多壽命數(shù)

10、天到數(shù)月 胞質(zhì)蛋白序列中決定其壽命的信號(hào)：N-端第一個(gè)Aa，若是Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly或Pro，則蛋白質(zhì)穩(wěn)定；如是其它12種Aa之一，則不穩(wěn)定。 每種蛋白質(zhì)合成后不久，N-端Met(細(xì)菌為甲酰Met)被特異氨基肽酶水解除去； 然后由氨酰-tRNA蛋白轉(zhuǎn)移酶(aminoacyl-tRNA-protein transferase)把一個(gè)信號(hào)Aa加N-端，決定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。 降解機(jī)制：依賴(lài)泛素的降解途徑(ubiquitin-dependent pathway)識(shí)別蛋白質(zhì)N-端不穩(wěn)定Aa信號(hào)，并降解。,泛素：76Aa小分子蛋白，主要作用是識(shí)別要被降解蛋白質(zhì)。 依賴(lài)于泛素

11、的26S蛋白酶體(proteosome)： 結(jié)構(gòu)：一個(gè)筒狀20S催化核心(core，14種多肽，28個(gè)亞基)，兩端各一個(gè)19S調(diào)節(jié)部分(cap，15個(gè)亞基)。 含量：占細(xì)胞蛋白總量1。 存在：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞核。 蛋白質(zhì)的泛素化過(guò)程,蛋白質(zhì)的泛素化過(guò)程：三步 ATP供能，泛素C端與非特異性泛素活化酶E1的Cys共價(jià)結(jié)合，形成E1-泛素復(fù)合物。 再將泛素轉(zhuǎn)移給泛素結(jié)合酶E2。 特異性泛素蛋白連接酶E3完成靶蛋白與泛素連接(E2也可將泛素直接轉(zhuǎn)移到靶蛋白的Lys)。 每次添加一個(gè)泛素，多個(gè)泛素結(jié)合到含不穩(wěn)定Aa的蛋白N-端。 26S蛋白酶體將蛋白完全水解。,蛋白質(zhì)降解過(guò)程： 多個(gè)泛素分子共價(jià)結(jié)合到

12、含不穩(wěn)定Aa的蛋白質(zhì)N-端； 26S蛋白酶體將蛋白質(zhì)完全水解。,N-寡糖酶(N-glycanase或PNGase) ：可切除錯(cuò)誤折疊糖蛋白上的N-寡糖鏈，并可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)降解(endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD)途徑中的多種關(guān)鍵成分相結(jié)合。,（3）降解變性和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì) 不管其N(xiāo)-端Aa是否穩(wěn)定，胞質(zhì)基質(zhì)中非正常蛋白，也會(huì)很快被清除。 推測(cè)原因：畸形蛋白質(zhì)暴露出的氨基酸疏水基團(tuán)的識(shí)別，由此啟動(dòng)對(duì)蛋白質(zhì)N-端第一個(gè)Aa的作用，形成了N-端不穩(wěn)定Aa，依賴(lài)于泛素蛋白降解途徑徹底水解。,（4）幫助變性或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊，形成

13、正確的分子構(gòu)象 主要依靠：熱休克蛋白(heat shock protein 或稱(chēng)stress-response protein，hsp，molecular chaperones分子伴侶)。 熱休克蛋白分3個(gè)家族：25kD，70kD和90kD 表達(dá)時(shí)期：有些在正常條件下表達(dá)； 有些則在異常時(shí)大量表達(dá)，以保護(hù)細(xì)胞，減少 異常環(huán)境的損傷。 修復(fù)機(jī)制：熱休克蛋白選擇性與畸形蛋白質(zhì)結(jié)合形成聚合物，利用水解ATP，使聚集的蛋白質(zhì)溶解，并進(jìn)一步折疊成正確構(gòu)象的蛋白質(zhì)。,分子伴侶（molecular chaperones） 細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)分子可以識(shí)別正在合成的多肽或部分折疊的多肽并與多肽的某些部位相結(jié)合，

14、從而幫助這些多肽轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊或裝配，這類(lèi)分子本身并不參與最終產(chǎn)物的形成，因此稱(chēng)為分子伴侶。,分子伴侶（ molecular chaperones ）和折疊酶（folding enzymes, foldases)： GroEL-GroES分子伴侶系統(tǒng)對(duì)于新合成蛋白的折疊是非常重要的。這兩種蛋白質(zhì)組成了一個(gè)由兩個(gè)穴（GroEL）和一個(gè)蓋子（GroES）組成的圓柱，底物進(jìn)入這個(gè)圓柱，進(jìn)行折疊，然后釋放。,第二節(jié)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)及其功能,細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)(endomembrane system)的研究方法：電鏡技術(shù)(超微結(jié)構(gòu))；免疫標(biāo)記和放射自顯影技術(shù)(功能定位)；組分離心技術(shù)(組分分析)；遺傳突變體分析(膜泡

15、運(yùn)輸和功能機(jī)制研究) 一.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能 二.高爾基體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能 三.溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能 ER相當(dāng)于物質(zhì)供應(yīng)站，Golgi為集散中心。,一.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能,(一)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)結(jié)構(gòu) 1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)現(xiàn) 2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和發(fā)生 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類(lèi)型 (二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能 1.蛋白質(zhì)的合成(rER主要功能) 2.脂質(zhì)的合成(sER合成) 3.蛋白質(zhì)的修飾與加工 4.新生多肽的折疊與組裝 5.其它功能 (三)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與基因表達(dá)的調(diào)控,1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)現(xiàn)： 1897年，Garnier：動(dòng)質(zhì)(ergastoplasm），可被堿性染料顯色； 19

16、45年, K. R. Porter等初次觀(guān)察到，并命名為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)； 1954年,Palade和Porter等,證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由膜圍繞的囊泡所組成。,2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)生 封閉管狀或扁平囊狀膜系統(tǒng)及其包被的腔，形成互相溝通的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。 一端通過(guò)與核膜聯(lián)系，另一端沿微管向外延伸。 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性：細(xì)胞周期內(nèi)，經(jīng)歷解體與重建，變化復(fù)雜；不同類(lèi)型細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同發(fā)育階段和生理狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)也有明顯變化。 發(fā)生：可能起源于細(xì)胞質(zhì)膜，與核膜同源；自我組裝，rER合成膜蛋白、sER合成膜脂。,大小通常占細(xì)胞膜系統(tǒng)一半，體積占細(xì)胞總體積10以上。,3.內(nèi)

17、質(zhì)網(wǎng)分類(lèi)(根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能) 糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)rER：扁囊狀，與核糖體形成復(fù)合結(jié)構(gòu)。 主要功能：合成分泌性蛋白和膜蛋白。(分泌細(xì)胞發(fā)達(dá)) 易位子(translocon)：多肽Sec61p等形成的蛋白復(fù)合體。直徑約8.5nm，中心有2nm通道。功能為新合成多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道。 光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)sER：小管、小囊狀。 主要功能：脂類(lèi)合成；作為出芽位點(diǎn)，將合成的蛋白質(zhì)或脂類(lèi)轉(zhuǎn)移到高爾基體內(nèi)。在固醇類(lèi)激素合成細(xì)胞和肝細(xì)胞發(fā)達(dá)。 兩者差異研究實(shí)驗(yàn)：密度梯度離心。,微粒體（microsome）,微粒體(microsome)：即破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，生物化學(xué)家從細(xì)胞質(zhì)中分離出的結(jié)構(gòu)。 微粒體用途：體外實(shí)驗(yàn)中，用于上述功能的分析研

18、究。因其仍具有蛋白質(zhì)合成，蛋白質(zhì)糖基化和脂類(lèi)合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能。,Electron micrograph of rough ER microsomes,密度梯度離心技術(shù)：6肝細(xì)胞中的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有20余種與光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上不同的蛋白質(zhì)。 因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上可能有某些特殊的裝置，將光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的部位間隔開(kāi)來(lái)，并維持其形態(tài)。否則膜上成分將趨于側(cè)向擴(kuò)散平衡。,4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布、定位與進(jìn)化： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有時(shí)向外與內(nèi)折疊的細(xì)胞質(zhì)膜相連接，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能由細(xì)胞質(zhì)膜演化而來(lái)。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜常向內(nèi)與外層核膜連接，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與核周隙相溝通，外核膜有時(shí)附著大量的核糖體，反映了核-質(zhì)間的物質(zhì)交

19、換和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與核膜在發(fā)生上的同源關(guān)系。推測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一端固定在核膜上，另一端在一種微管馬達(dá)蛋白驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）的牽引下沿微管向外延伸形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體在結(jié)構(gòu)、功能與發(fā)生上的關(guān)系密切。 合成旺盛的細(xì)胞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線(xiàn)粒體緊密相依，線(xiàn)粒體為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能量的“供應(yīng)站”；同時(shí)，兩細(xì)胞器間還發(fā)生脂類(lèi)相互交換及Ca2+釋放調(diào)節(jié)。,1.蛋白質(zhì)合成：均起始于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，一些核糖體起始蛋白質(zhì)合成不久，便轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，再進(jìn)行合成。共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白類(lèi)型,蛋白合成和轉(zhuǎn)移,Co-translational transport across ER membrane!,post-translat

20、ional transport,共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)（Cotranslational translocation）蛋白質(zhì)類(lèi)型： （1）胞外分泌蛋白：分泌泡形式胞吐到胞外。 （2）膜整合蛋白：細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體的膜蛋白等，具有方向性。 （3）內(nèi)膜系統(tǒng)細(xì)胞器內(nèi)的可溶性駐留蛋白：需要與其它細(xì)胞組分嚴(yán)格隔離，如溶酶體與植物液泡中酸性水解酶等。,How does ER signal peptide direct the ribosome to the ER membrane?,當(dāng)信號(hào)肽從核糖體中伸出，信號(hào)識(shí)別顆粒(signal recognition particle,SRP)就結(jié)合到信號(hào)肽上，肽

21、鏈暫停延伸 SRP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的內(nèi)在蛋白受體（停泊蛋白）結(jié)合 核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的易位子（translocon）結(jié)合，肽鏈又開(kāi)始延伸 SRP脫離信號(hào)肽和核糖體，返回細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)重新使用 信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)合成,信號(hào)識(shí)別顆粒,信號(hào)識(shí)別顆粒受體,易位子,信號(hào)肽酶,信號(hào)序列,可溶性蛋白質(zhì),信號(hào)肽識(shí)別顆粒:由6種多肽和一個(gè)7S的RNA組成，分子量325000,信號(hào)肽序列結(jié)合位點(diǎn),SRP受體結(jié)合位點(diǎn),翻譯停止區(qū),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的移位子（translocon）為蛋白復(fù)合體，直徑約8.5nm，中心有一個(gè)直徑為2nm的“通道”，其功能與新合成的多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，移位子

22、的主要成分是與蛋白分泌相關(guān)的一種多肽Sec61p等組成復(fù)合物。,2.脂質(zhì)的合成：包括磷脂和膽固醇等幾乎全部的膜脂。 磷脂的合成 合成磷脂的轉(zhuǎn)位 合成磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)方式,磷脂的合成:脂酰膽堿的合成為例 所需的3種酶：?；D(zhuǎn)移酶、磷酸酶和膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶。 活性部位：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞質(zhì)基質(zhì)側(cè)； 合成底物來(lái)源：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。 第一步增大膜面積；第二、三兩步確定新合成磷脂種類(lèi)。,脂質(zhì)的轉(zhuǎn)位：新合成磷脂幾分鐘后，轉(zhuǎn)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔面，速度比自然轉(zhuǎn)位高105倍。 原因：借助磷脂轉(zhuǎn)位因子(phospholipid translocator)或稱(chēng)轉(zhuǎn)位酶(flippase)。 其中，膽堿磷脂的轉(zhuǎn)位能力強(qiáng)于對(duì)含絲氨酸、乙醇胺和肌醇磷

23、脂。,脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式：兩種 （1）出芽：高爾基體，溶酶體，細(xì)胞膜中。 （2）水溶性磷脂轉(zhuǎn)換蛋白(phospholipid exchange proteins，PEP)：線(xiàn)粒體、葉綠體、過(guò)氧物酶體中。PEP具專(zhuān)一性，運(yùn)載特定種類(lèi)磷脂。 轉(zhuǎn)運(yùn)模式：PEP與磷脂分子結(jié)合形成水溶性復(fù)合物細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)自由擴(kuò)散靶膜PEP將磷脂釋放、安插于靶膜。,3.蛋白質(zhì)的修飾和加工 主要化學(xué)修飾作用包括： （1）N-連接的糖基化 （2）?；?發(fā)生部位：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)側(cè)，或高爾基體、膜蛋白向細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移的過(guò)程中。 作用方式：常以軟脂酸共價(jià)結(jié)合于跨膜蛋白Cys。 （3）蛋白質(zhì)二硫鍵形成(同后面4),蛋白二硫鍵異構(gòu)酶,（1）N-

24、連接的糖基化 發(fā)生位置：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔面。 膜上糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl tranferase)作用下，將寡糖基鏈由膜內(nèi)磷酸多萜醇轉(zhuǎn)移到糖基化有關(guān)蛋白Asn。,真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)糖基化修飾的類(lèi)型：兩大類(lèi) N-連接糖基化：開(kāi)始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，N-乙酰葡萄糖胺連接到跨膜蛋白Asn。 O-連接糖基化：發(fā)生于高爾基體， N-乙酰半乳糖糖胺連接到Ser、Thr或膠原纖維中羥賴(lài)氨酸或羥脯氨酸羥基。,寡糖鏈由14個(gè)糖分子構(gòu)成： 2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺， 9個(gè)甘露糖 3個(gè)葡萄糖,X為除Pro以外的任何氨基酸,rER內(nèi)糖蛋白在被運(yùn)送到高爾基體前，切除了寡糖鏈上的3個(gè)葡萄糖分子和1個(gè)甘露糖分子,糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的N-連接蛋白質(zhì)糖

25、基化過(guò)程：,4.蛋白質(zhì)折疊和組裝：數(shù)十秒或數(shù)分鐘新合成多肽，還需在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留幾十分鐘進(jìn)行折疊和修正。 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)加快新合成蛋白的正確折疊 結(jié)合蛋白(binding protein, Bip)識(shí)別重組裝不正確蛋白 錯(cuò)誤折疊多肽的降解 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白的序列特征： PDI和Bip等都具有4肽信號(hào)(KDEL或HDEL，Lys/His-Asp -Glu-Leu )，保證其滯留/返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并維持高濃度。,錯(cuò)誤折疊多肽的降解（無(wú)法修復(fù)蛋白）： 移位子復(fù)合物(Sec61p復(fù)合物)轉(zhuǎn)運(yùn) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤多肽細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)泛素依賴(lài)降解途徑prot

26、easome降解，壽命530 min(先除去糖分子，再降解),蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）： 發(fā)生位置：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔面。 功能：加快新合成蛋白的正確折疊，切斷不正確二硫鍵，重新形成正確二硫鍵，并幫助折疊與組裝，形成自由能最低的正確構(gòu)象。,結(jié)合蛋白（binding protein, Bip）識(shí)別重組裝不正確蛋白： Bip屬于Hsp70(熱休克蛋白)家族成員。 位置：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)；可與Ca2+結(jié)合橋連帶負(fù)電的磷脂頭部基團(tuán)，使Bip結(jié)合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。 功能：識(shí)別不正確折疊或未組裝好蛋白亞基(疏水部分外露，易發(fā)生聚集)，并促進(jìn)重新折疊與組裝，形成正確構(gòu)象

27、或組裝完成，新生成蛋白與Bip分離。,5.其它功能（光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)） （1）合成外輸性脂蛋白顆粒： 肝細(xì)胞含豐富光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 （2）解毒功能： 肝細(xì)胞光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含一些酶，可清除脂溶性廢物和代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)。如，細(xì)胞色素P450(多功能氧化酶mixed-function oxidase)催化各種脂溶性物質(zhì)化合物羥基化或單加氧反應(yīng)。 （3）合成固醇類(lèi)激素： 睪丸間質(zhì)細(xì)胞光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，含有制造膽固醇，并進(jìn)一步產(chǎn)生固醇類(lèi)激素的系列酶。 （4）儲(chǔ)存Ca2+ 功能： 肌細(xì)胞的肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum)為特化的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其膜上Ca2+-ATP酶將細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的Ca2+ 泵入肌質(zhì)

28、網(wǎng)腔中，通過(guò)鈣結(jié)合蛋白(30 Ca2+/每蛋白分子)儲(chǔ)存起來(lái)。 （5）還有物質(zhì)的儲(chǔ)存、運(yùn)輸，能量、信息傳遞、細(xì)胞的支持和運(yùn)動(dòng)等功能。,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)除核酸以外一系列重要的生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和糖類(lèi)合成的基地。 原核細(xì)胞由細(xì)胞質(zhì)膜代行其類(lèi)似功能。,（三）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與基因表達(dá)的調(diào)控 多種蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊、組裝、加工、包裝，及向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)，需要有一個(gè)精確調(diào)控的過(guò)程。 三種調(diào)節(jié)核內(nèi)特異基因表達(dá)的從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑： （1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白的超量積累。 （2）折疊好的膜蛋白的超量積累。 （3）網(wǎng)膜上膜脂成份的變化主要是固醇缺乏。 這些變化可通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)不同的基因活化，以保證

29、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常行使其功能。,二.高爾基體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能（Golgi body, Golgi apparatus， Golgi complex）,高爾基體的發(fā)現(xiàn)及確認(rèn) （一）高爾基體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與極性 （二）高爾基體的功能,高爾基體的發(fā)現(xiàn): 1898年，意大利醫(yī)生Camillo Golgi用鍍銀法首次在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)觀(guān)察到一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，命名為內(nèi)網(wǎng)器（internal reticular apparatus）。 高爾基體的存在經(jīng)半個(gè)世紀(jì)才確認(rèn)，并明確普遍存在。 原因：光學(xué)顯微鏡的局限性； 高爾基體的自身結(jié)構(gòu)特征： 由大小不一、形態(tài)多變的囊泡體系組成； 很難分離與純化； 動(dòng)物細(xì)胞中數(shù)目較少(肝細(xì)胞較豐富僅5

30、0個(gè)左右)。,（）3高爾基體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與極性 高爾基體形態(tài)特征：48個(gè)扁平囊呈弓形或球形堆疊(saccules,直徑1m,囊間距1530nm)，周?chē)写笮〔坏鹊哪遗荨?高爾基體的極性 高爾基體結(jié)構(gòu)：相互聯(lián)系的3個(gè)部分，又可分為更精細(xì)的間隔。 1.順面膜囊或順面管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(cis Golgi network，CGN) 2.中間膜囊（medial Golgi） 3.反面膜囊及反面管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（trans Golgi and trans Golgi network TGN） 高爾基體周?chē)哪遗?各膜囊層間聯(lián)系：均由膜性結(jié)構(gòu)連接；膜囊周緣囊泡可能由膜囊出芽形成，負(fù)責(zé)膜囊間物質(zhì)運(yùn)輸。,高爾基體的極性： （

31、1）細(xì)胞中的位置和方向： 位置：較恒定。非極性細(xì)胞中，分布于微管組織中心(MTOC)負(fù)端，周?chē)形⒔z、微管的馬達(dá)蛋白，和血影蛋白網(wǎng)架。 方向：順面(cis face，形成面，凸面） 反面(trans face，成熟面，凹面） （2）物質(zhì)運(yùn)輸：經(jīng)各不相同各層膜囊，一側(cè)進(jìn)入，另一側(cè)輸出。 （3）生化極性：細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)(組織化學(xué)染色)結(jié)合電鏡分析，各膜囊具有不同的特有成分。,種常用標(biāo)志電鏡細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的成分差異性分析： （1）嗜鋨反應(yīng)：經(jīng)鋨酸浸染后，cis面膜囊特異性染色； （2）煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（NADP酶）或甘露糖苷酶反應(yīng)：中間幾層扁平囊的標(biāo)志反應(yīng)； （3）焦磷酸硫胺素酶（TPP酶）反應(yīng)

32、：特異性顯示trans面的12層膜囊；,A.Stained for Cis-Golgi、 B. Stained for medial-Golgi、 C.Stained for Trans-Golgi *鋨酸染色 甘露糖苷酶染色 核苷酸二磷酸酶染色,（4）胞嘧啶單核苷酸酶（CMP酶，溶酶體標(biāo)志酶）或核苷酸二磷酸酶的反應(yīng)：顯示靠近trans面的一些膜囊和管狀結(jié)構(gòu)。即GERL結(jié)構(gòu)。也可用C5/6-NBP/DMB-神經(jīng)酰胺標(biāo)記。 60年代初，Novikoff發(fā)現(xiàn)CMP酶和酸性磷酸酶存在的高爾基體的一側(cè)，稱(chēng)GERL，意為與高爾基體（G）密切相關(guān)，但為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）一部分，又參與溶酶體（L）生成。當(dāng)時(shí)認(rèn)為

33、溶酶體中的酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，通過(guò)GERL而不經(jīng)過(guò)高爾基體進(jìn)入溶酶體。,A.Stained for Cis-Golgi、 B. Stained for medial-Golgi、 C.Stained for Trans-Golgi *鋨酸染色 甘露糖苷酶染色 核苷酸二磷酸酶染色,1.順面膜囊或順面管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，CGN，cis膜囊：膜厚約6nm，略薄，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜厚度接近。 形態(tài)：呈中間多孔而連續(xù)分支狀管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的扁平膜囊。 主要功能：接受ER新合成物質(zhì)，分類(lèi)后，大部分轉(zhuǎn)入中間膜囊，小部分蛋白質(zhì)(KDEL或HDEL)與脂類(lèi)再返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 其它生物活性：蛋白上Ser發(fā)生O-連接糖基化；跨膜蛋白在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)

34、一側(cè)結(jié)構(gòu)域?；?；日冕病毒組裝。,2.中間膜囊medial Golgi 形態(tài)：扁平膜囊與管道組成，形成不同間隔，功能上是連續(xù)的、完整的膜囊體系。 主要功能：多數(shù)蛋白糖基修飾、糖脂形成，及多糖合成。,3.反面膜囊及反面管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)trans Golgi and trans Golgi network，TGN 形態(tài)：反面最外層扁平膜囊，及伸向胞質(zhì)管網(wǎng)和連接囊泡。 主要功能：參與蛋白質(zhì)分類(lèi)與包裝，及輸出(“瓣膜”作用)； 某些“晚期”蛋白質(zhì)修飾：如，半乳糖()-2,6位唾液酸化、蛋白質(zhì)Lys硫酸化、蛋白原水解加工等。,不同細(xì)胞器結(jié)構(gòu)常用的熒光染料： 線(xiàn)粒體適用的熒光探針較多，如Mitotracker、

35、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、Rhodamine 123等。 高爾基復(fù)合體常用的熒光探針有NBD ceramide、BODIPY ceramide、C5-DMB-ceramide 。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要用Dil、DiOC6(3)。 溶酶體的熒光探針有DAMP、neutral red。 有報(bào)道選用NBC-PC標(biāo)記細(xì)胞膜、Mitotracker標(biāo)記線(xiàn)粒體、Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核DNA，同時(shí)顯示細(xì)胞的三部分結(jié)構(gòu)。,高爾基器的熒光照片,Typical plant cell has hundreds of individual stacks dispersed throughout c

36、ell,Golgi is polarized in animal cells,高爾基體周?chē)哪遗?（1）順面一側(cè)的囊泡：可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體間物質(zhì)運(yùn)輸小泡，稱(chēng)為ERGIC(endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment)，或稱(chēng)VTCs(Vesicular-tubular clusters)。 標(biāo)志蛋白：ERGIC53/58蛋白，有與甘露糖結(jié)合特性的凝集素；推測(cè)功能分泌蛋白早期起分選、包入特定囊泡。 （2）反面一側(cè)體積較大的分泌泡和顆粒：功能將經(jīng)過(guò)分類(lèi)與包裝的物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞特定的部位。,（二）高爾基體的功能 主要功能： (1)將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合

37、成蛋白質(zhì)(連同脂質(zhì))加工、分類(lèi)與包裝，分門(mén)別類(lèi)地運(yùn)送到細(xì)胞特定的部位或分泌到胞外。 (2)胞內(nèi)糖類(lèi)合成工廠(chǎng)。 Golgi是細(xì)胞內(nèi)大分子運(yùn)輸?shù)囊粋€(gè)主要交通樞紐。 1.高爾基體與細(xì)胞的分泌活動(dòng) 2.蛋白質(zhì)的糖基化及其修飾 3.蛋白酶的水解和其它加工過(guò)程 高爾基體功能小結(jié),1.高爾基體與細(xì)胞的分泌活動(dòng) (1)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：高爾基體與細(xì)胞分泌性蛋白分泌關(guān)系 (2)高爾基體對(duì)蛋白質(zhì)的分類(lèi)與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究 例，溶酶體所有酶的共同標(biāo)志6-磷酸甘露糖（M6P） 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白多為糖蛋白：包括溶酶體水解酶、多數(shù)細(xì)胞質(zhì)膜膜蛋白和分泌蛋白。 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞核中蛋白質(zhì)多數(shù)無(wú)糖基化修飾或僅簡(jiǎn)單糖基化修飾。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白是

38、否都通過(guò)糖基識(shí)別完成分選運(yùn)輸？,實(shí)驗(yàn)證實(shí)Golgi與細(xì)胞分泌性蛋白關(guān)系 1970年代初，Caro用3H-亮氨酸脈沖標(biāo)記胰腺的腺泡細(xì)胞，顯示分泌性蛋白在胞內(nèi)合成與轉(zhuǎn)運(yùn)途徑： 3分鐘后，放射自顯影銀粒主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； 20分鐘后，出現(xiàn)在高爾基體； 120分鐘后，位于分泌泡，開(kāi)始在頂端釋放。 此種轉(zhuǎn)運(yùn)途徑運(yùn)送物質(zhì)：還包括細(xì)胞質(zhì)膜蛋白、溶酶體酸性水解酶及胞外基質(zhì)等。,例，溶酶體酶的轉(zhuǎn)運(yùn)：共同標(biāo)志6-磷酸甘露糖(M6P) 60年代發(fā)現(xiàn)，70年代證明，80年代純化了反應(yīng)有關(guān)酶及M6P受體。 溶酶體酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成時(shí)，發(fā)生了N連接糖基化修飾(Asn加寡糖鏈)。 溶酶體酶形成多位點(diǎn)M6P，增加與6-磷酸甘露糖受

39、體(Golgi反面膜囊)親和力，實(shí)現(xiàn)局部濃縮。 （N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶單基因突變引起的I細(xì)胞疾病）,rER內(nèi)糖蛋白在被運(yùn)送到高爾基體前，切除了寡糖鏈上的3個(gè)葡萄糖和1個(gè)甘露糖。,細(xì)胞內(nèi)含物?。╥nclusion-cell disease，I-cell disease）： 一種更嚴(yán)重的貯積癥，由N-乙酰葡糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶單基因突變引起，高爾基體中加工的溶酶體前酶上不能形成M6P分選信號(hào)，酶被運(yùn)出細(xì)胞（default pathway）。 這類(lèi)病人成纖維細(xì)胞的溶酶體中沒(méi)有水解酶，導(dǎo)致底物在溶酶體中大量貯積，形成所謂“包涵體（inclusion）”。 但這類(lèi)病人肝細(xì)胞中有正常溶酶體，說(shuō)明溶酶體形成

40、還具有M6P之外的途徑。,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白是否都通過(guò)糖基識(shí)別完成分選運(yùn)輸？ 糖基識(shí)別的特異反應(yīng)，僅發(fā)生于溶酶體酶。 多數(shù)蛋白質(zhì)的分選信息僅存在于編碼蛋白質(zhì)基因本身。 例，一些膜蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)一側(cè)的雙酸分選信號(hào)(Asp-x-Gln或DxE)，對(duì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)起重要的作用。,另外發(fā)現(xiàn)，小分子G蛋白(GTP binding regulatory protein,G protein)Rab調(diào)節(jié)Golgi囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。,流感病毒和水泡性口炎病毒同時(shí)感染上皮細(xì)胞 流感病毒(HA)包膜蛋白特異性轉(zhuǎn)運(yùn)上皮細(xì)胞游離端質(zhì)膜。 水泡性口炎病毒(VSV)包膜蛋白特異性轉(zhuǎn)運(yùn)上皮細(xì)胞基底面質(zhì)膜。 兩基因

41、同時(shí)在上皮細(xì)胞表達(dá)，與分別表達(dá)分布相同。 水泡性口炎病毒(VSV)包膜蛋白特異性轉(zhuǎn)運(yùn)與其Golgi胞質(zhì)基質(zhì)側(cè)雙酸分選信號(hào)(Asp-X-Gln或DXE)起重要作用。,2.蛋白質(zhì)的糖基化及其修飾，和糖脂與多糖的形成 糖基化組裝途徑模式：糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白大多在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中發(fā)生糖基化和有序加工與修飾；不同的單糖殘基或寡糖鏈和相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶均位于特定間隔，形成一個(gè)組裝流水線(xiàn)。 蛋白質(zhì)糖基化的原因 蛋白質(zhì)糖基化的類(lèi)型： （1）N-連接糖基化 （2）O-連接的糖基化，兩者的比較： 相同點(diǎn)： 糖基化最后一步與復(fù)雜N-連接糖基化相同，在Golgi體反面膜囊或TGN，加唾液酸殘基，10min運(yùn)達(dá)目的地；

42、 所有加工相關(guān)的酶均為整合膜蛋白，且其活性部位均位于Er或Golgi腔面。 （3）蛋白聚糖（4）糖脂（5）多糖形成,為什么蛋白質(zhì)要糖基化? 有利于高爾基體分類(lèi)和包裝，保證糖蛋白在內(nèi)膜系統(tǒng)單方向轉(zhuǎn)移。 影響多肽構(gòu)象，保證正確折疊。衣霉素(tunicamycin)阻斷蛋白糖基化，導(dǎo)致其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留。 增強(qiáng)糖蛋白穩(wěn)定性，對(duì)蛋白酶抗性。成纖維細(xì)胞分泌纖連蛋白 (fibronectin)。 影響蛋白質(zhì)水溶性和帶電荷性質(zhì)。 保護(hù)細(xì)胞表面膜蛋白免于其他大分子接近（選擇性識(shí)別），既有剛性又有彈性。,（1）N-連接糖基化 根據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)特征可分為兩種： 高甘露糖N-連接寡糖(high mannose N-linke

43、d oligosacchiride)，只含N-乙酰葡萄糖和甘露糖， 復(fù)雜N-連接寡糖(complex N-linked oligosacchiride)，除含N-乙酰葡萄糖和甘露糖，還含巖藻糖、半乳糖和唾液酸 最后形成成熟糖蛋白寡糖鏈，都含2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺和3個(gè)甘露糖殘基。 復(fù)雜N-連接寡糖在rER和Golgi各間隔轉(zhuǎn)移加工過(guò)程,Glycosylation in the Golgi apparatus,Core region,Complex oligosaccharide,High mannose oligosaccharide,rER內(nèi)糖蛋白在被運(yùn)送到高爾基體前，切除了寡糖鏈上的3個(gè)葡萄

44、糖和1個(gè)甘露糖。,糖基轉(zhuǎn)移定位：特定三肽序列的天冬酰胺殘基(Asn-X-Ser/Thr，X為除Pro以外氨基酸),寡糖鏈構(gòu)成：14個(gè)糖分子 2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺， 9個(gè)甘露糖， 3個(gè)葡萄糖,Glycosylation in the Golgi apparatus,ER內(nèi)的糖基化修飾和加工 除去3個(gè)葡萄糖1個(gè)甘露糖,Golgi內(nèi)除去3個(gè)甘露糖,Golgi內(nèi)添加1個(gè)N-乙酰葡萄糖,Glycosylation in the Golgi apparatus,此后，10min內(nèi)轉(zhuǎn)送到目的地,糖基化組裝途徑模式： 相關(guān)催化酶的分布：均為整合膜蛋白，固定于不同間隔，活性部位均位于Er或Golgi腔內(nèi)。 甘露

45、糖轉(zhuǎn)移酶存在rER，半乳糖或巖藻糖轉(zhuǎn)移酶存在于Golgi反面膜囊，唾液酸轉(zhuǎn)移酶存在于Golgi反面膜囊和TGN。(電鏡放射自顯影或不同寡糖鏈合成抑制劑法顯示) 底物載體蛋白(介導(dǎo)反應(yīng)底物核苷酸單糖對(duì)向協(xié)同運(yùn)輸從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到Golgi囊腔內(nèi))的分布：也存在于不同間隔膜上，以維持腔內(nèi)特定區(qū)域特定反應(yīng)底物的濃度和特異反應(yīng)。 不同間隔中，寡糖鏈的合成與加工象一條組裝流水線(xiàn)。,(2)O-連接的糖基化： 寡糖成分和結(jié)構(gòu)、合成與加工的方式完全不同。,N-連接與O-連接的糖基化比較,（3）蛋白聚糖形成：Golgi中，有多個(gè)糖胺聚糖通過(guò)木糖O-連接到核心蛋白絲氨酸上。 （4）糖脂的糖基化：糖脂的糖側(cè)鏈也以糖

46、蛋白相同的途徑和方式合成與加工，由Golgi轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體膜或細(xì)胞質(zhì)膜上。 （5）多糖形成：植物細(xì)胞中，Golgi合成和分泌多種多糖，至少含12種以上單糖，多數(shù)多糖呈分支狀且有很多共價(jià)修飾，復(fù)雜于動(dòng)物細(xì)胞。 估計(jì)構(gòu)成植物細(xì)胞典型初生壁的過(guò)程涉及數(shù)百種酶： 多數(shù)酶都存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中。 少數(shù)酶共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁，如多數(shù)植物細(xì)胞的纖維素是由細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)的纖維素合成酶合成。,3.蛋白酶的水解和其它加工過(guò)程 （1）蛋白酶的水解 蛋白質(zhì)在高爾基體中酶解加工的方式可歸納為四類(lèi)： 1）無(wú)生物活性的蛋白原(proprotein)：將N-端或兩端序列切除而成熟。如胰島素、胰高血糖素及血清蛋白。 2）含有多個(gè)相

47、同氨基酸序列的前體：水解成同種有活性的多肽。如神經(jīng)肽(neuropeptides，5肽)等。 3）含有不同信號(hào)序列的蛋白分子前體，可加工成不同產(chǎn)物；或同一種蛋白前體在不同細(xì)胞，最后加工成不同產(chǎn)物。 不同的多肽采用不同的加工方式的原因（推測(cè)） （2）硫酸化作用：主要為蛋白聚糖在高爾基體內(nèi)組裝。 硫酸根供體：3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸(3-phosphoadenosine -5- phosphosulfate，PAPS)，從胞質(zhì)基質(zhì)中轉(zhuǎn)入高爾基體膜囊內(nèi)，酶催化，將硫酸根轉(zhuǎn)移到肽鏈Lys羥基。,不同的多肽采用不同的加工方式的原因（推測(cè)）： 有些多肽分子太小，在核糖體上難以有效地合成，如5Aa神經(jīng)肽；

48、 有些可能缺少包裝并轉(zhuǎn)運(yùn)到分泌泡中的必要信號(hào)； 可以有效地防止這些活性物質(zhì)在合成它的細(xì)胞內(nèi)起作用。 例，胰島素、消化酶等。,高爾基器的功能分區(qū),溶酶體蛋白質(zhì)上的寡糖鏈被磷酸化 進(jìn)一步修飾 來(lái)自?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的 N-linked的糖分子 （除去甘露糖，除去甘露糖和添加N-乙酰葡萄糖，添加半乳糖和唾液酸） 新合成 O-linked的糖分子 酪氨酸和碳水化合物被硫酸化 NOTE: Data shows that processing occurs in a spatial as well as a biochemical sequence.,高爾基體的功能,蛋白質(zhì)的糖基化加工： 形成O-連接的糖苷鍵； 進(jìn)一

49、步加工N-連接的糖苷鍵。 分選包裝和分泌活動(dòng) 合成和分泌多糖，并參與細(xì)胞壁的形成 細(xì)胞內(nèi)的膜泡運(yùn)輸 溶酶體的發(fā)生,三.溶酶體(及過(guò)氧化物酶體)形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能 Lysosome and peroxisome(microbody),溶酶體發(fā)現(xiàn)和分布 （一）溶酶體的結(jié)構(gòu)類(lèi)型 （二）溶酶體的功能 （三）溶酶體的發(fā)生 （四）溶酶體與過(guò)氧化物酶體,溶酶體發(fā)現(xiàn)： 1949年，de Duve將大鼠肝組織勻漿，用差速離心方法，分析細(xì)胞組分(與線(xiàn)粒體共組分)，測(cè)定酸性磷酸酶活性時(shí)，分析出溶酶體的存在。 1955年，de Duve與Novikoff合作首次用電子顯微鏡證明了溶酶體的存在。 溶酶體顯示：標(biāo)志酶反應(yīng)(酸

50、性磷酸酶,acid phosphatase)，可辨認(rèn)不同形態(tài)(多泡體、線(xiàn)狀)與大小的溶酶體；并可研究溶酶體的發(fā)生與成熟過(guò)程。 分布： 存在于動(dòng)物細(xì)胞，約含數(shù)百個(gè)；植物細(xì)胞有功能類(lèi)似的細(xì)胞器圓球體、糊粉粒及液泡(含有多種水解酶類(lèi))；原生動(dòng)物細(xì)胞也存在類(lèi)似溶酶體結(jié)構(gòu)。,（一）溶酶體的結(jié)構(gòu)類(lèi)型 溶酶體(lysosome)：?jiǎn)螌幽@、內(nèi)含多種酸性水解酶類(lèi)的囊泡狀細(xì)胞器。 溶酶體的異質(zhì)性(heterogenous)：指不同溶酶體的形態(tài)大小不同，所包含水解酶種類(lèi)不同，執(zhí)行生理功能不同。 類(lèi)型：根據(jù)所處完成其生理功能的不同階段 初級(jí)溶酶體（primary lysosome）、 次級(jí)溶酶體（secondar

51、y lysosome）、 殘余體（residual body）,1.初級(jí)溶酶體： （1）形態(tài)：球形，直徑0.20.5m，內(nèi)容物均一，不含明顯顆粒物質(zhì)，由一層7.5nm厚的脂蛋白膜圍繞。 （2）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 內(nèi)含物：多種水解酶，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷脂酶、磷酸酶和硫酸酶等。 溶酶體酶的共同特征： 均屬酸性水解酶，最適pH為5左右，pH7時(shí)即失活； 都具有某些特征的同源序列； 本身結(jié)構(gòu)都能抗御酸變性作用。 溶酶體膜成分與其它生物膜不同： 嵌有質(zhì)子泵：形成和維持H+濃度高出胞質(zhì)100倍； 具有多種載體蛋白：水解產(chǎn)物向外轉(zhuǎn)運(yùn)； 膜蛋白高度糖基化：防止自身膜蛋白降解。,2.次級(jí)溶酶體：初級(jí)溶酶

52、體與細(xì)胞內(nèi)的自噬泡或異噬泡、胞飲泡或吞噬泡融合形成的復(fù)合體，為正在行使消化作用的溶酶體。 分類(lèi)：根據(jù)消化的對(duì)象不同 自噬溶酶體（autophagolysosome） 異噬溶酶體（phagolysosome） 溶酶體消化作用的三種途徑： 吞噬作用、胞飲作用和自噬作用 (1)形態(tài)：不規(guī)則，直徑可達(dá)數(shù)微米。 (2)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 內(nèi)含物：多種生物大分子、顆粒性物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌等。,3.殘余體：或稱(chēng)后溶酶體，未被消化的物質(zhì)殘存于溶酶體而形成。 殘余體去向： 通過(guò)類(lèi)似胞吐方式排出內(nèi)容物； 形成脂褐質(zhì)體存在于細(xì)胞中。,（二）溶酶體的功能 主要功能：細(xì)胞內(nèi)消化作用(基本功能)，以維持細(xì)胞正常代謝活動(dòng)及防御微生

53、物侵染等。 1.清除無(wú)用的生物大分子、細(xì)胞器及細(xì)胞 2.防御功能 3.其它重要的生理功能：主要四種,1.清除無(wú)用生物大分子、衰老細(xì)胞器及衰老損傷和死亡細(xì)胞 細(xì)胞內(nèi)兩種主要清道夫：溶酶體和蛋白酶體 例，巨噬細(xì)胞通過(guò)溶酶體清除衰老紅細(xì)胞(120天壽命)。 衰老紅細(xì)胞表面糖鏈中的唾液酸殘基脫落，暴露出半乳糖殘基，被巨噬細(xì)胞識(shí)別并捕獲，進(jìn)而被吞噬和降解。 貯/儲(chǔ)積癥(storage disease)：由隱形遺傳缺陷引起的，溶酶體酶發(fā)生變異，功能喪失，導(dǎo)致底物在溶酶體中大量貯積，影響細(xì)胞功能，而引起的病癥。,常見(jiàn)的貯積癥主要類(lèi)型：為隱性遺傳病。 臺(tái)-薩氏綜合征(Tay-Sachs diesease)：溶

54、酶體缺少氨基已糖酯酶A(-N-hexosaminidase)，導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)苷脂GM2積累， 特別是腦細(xì)胞中，造成漸進(jìn)性失明、精神癡呆和癱瘓，26歲死亡。主要出現(xiàn)于猶太人群。正常人體或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，細(xì)胞膜的神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)GM2處于合成與降解的不斷更新?tīng)顟B(tài)。 II型糖原累積病(Pompe病)：溶酶體缺乏-1,4-葡萄糖苷酶，溶酶體中糖原積累，導(dǎo)致心、肝、舌腫大和骨骼肌無(wú)力。屬常染色體缺陷性遺傳病，患者多為小孩，常在兩周歲以前死亡。 腦苷脂沉積病(Gaucher病)：巨噬細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞的溶酶體缺乏- 葡萄糖苷酶。大量葡萄糖腦苷脂沉積在這些細(xì)胞溶酶體內(nèi),巨噬細(xì)胞變成Gauche

55、r細(xì)胞，患者肝、脾、淋巴結(jié)等腫大，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性變化，常在一歲內(nèi)死亡。,細(xì)胞內(nèi)含物病(inclusion-cell disease，I-cell disease)：一種嚴(yán)重貯積癥，N-乙酰葡糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶單基因突變，高爾基體中加工的溶酶體前酶上不能形成M6P分選信號(hào)，酶被運(yùn)出細(xì)胞（default pathway）。這類(lèi)病人成纖維細(xì)胞的溶酶體中沒(méi)有水解酶，導(dǎo)致底物在溶酶體中大量貯積，形成所謂的“包涵體（inclusion）”。 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎：溶酶體膜很易脆裂，水解酶釋放導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織損傷和發(fā)炎 。 矽肺：二氧化硅塵粒（矽塵）吸入肺泡后被巨噬細(xì)內(nèi)吞噬，含有矽塵的吞噬小體與溶酶體合并成為次級(jí)

56、溶酶體。二氧化硅的羥基與溶酶體膜的磷脂或蛋白形成氫鍵，導(dǎo)致吞噬細(xì)胞溶酶體崩解，細(xì)胞破壞，矽塵釋出，后又被其他巨噬細(xì)胞吞噬，如此反復(fù)。受損或已破壞的巨噬細(xì)胞釋放“致纖維化因子”，激活成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致膠原纖維沉積，肺組織纖維化。,2.防御功能：為某些細(xì)胞特有功能。識(shí)別并吞噬入侵病毒或細(xì)菌，將其殺死并降解。 機(jī)體感染單核細(xì)胞(monocyte)移至感染或發(fā)炎部位分化成巨噬細(xì)胞(macrophage)其發(fā)達(dá)的溶酶體與過(guò)氧化氫、超氧物(O2)等共同作用殺死細(xì)菌。 例外：麻瘋桿菌(Mycobacterium leprae)、利什曼原蟲(chóng)(Leishmania)可在巨噬細(xì)胞的吞噬泡中繁殖。致病機(jī)制：通過(guò)抑制吞

57、噬泡酸化，抑制溶酶體酶活性。 有些病毒利用溶酶體酸水解向細(xì)胞質(zhì)釋放病毒核殼。,3.其它重要的生理功能 （1）作為細(xì)胞內(nèi)的消化“器官”，為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。 如降解內(nèi)吞的血清脂蛋白，獲得膽固醇等營(yíng)養(yǎng)成分； 細(xì)胞饑餓時(shí)，溶酶體分解胞內(nèi)生物大分子提供能量。 （2）分泌腺細(xì)胞的溶酶體，常攝入分泌顆粒，參與分泌過(guò)程的調(diào)節(jié)。 如甲狀腺球蛋白(thyroglobin)儲(chǔ)存于甲狀腺體內(nèi)腔，通過(guò)吞噬作用進(jìn)入分泌細(xì)胞內(nèi)與溶酶體融合，甲狀腺球蛋白被水解為甲狀腺素，分泌到胞外毛細(xì)血管。 （3）某些凋亡細(xì)胞通過(guò)周?chē)罴?xì)胞溶酶體被清除。 如兩棲類(lèi)發(fā)育過(guò)程中蝌蚪尾巴的退化與溶酶體有關(guān)。,（4）完成受精作用。 精子頂體（acro

58、some）為特化溶酶體，其中含多種水解酶類(lèi)，如透明質(zhì)酸酶、酸性磷酸酶、-N-乙酰葡萄糖胺酶及蛋白水解酶等，能溶解卵細(xì)胞外被及濾泡細(xì)胞，產(chǎn)生孔道，使精子進(jìn)入卵細(xì)胞，完成受精。,（三）溶酶體的發(fā)生：可能為多途徑的復(fù)雜過(guò)程。 1.M6P分選途徑的胞內(nèi)溶酶體發(fā)生 2.不依賴(lài)于M6P的分選途徑,1.M6P分選途徑的胞內(nèi)溶酶體發(fā)生：,TGN轉(zhuǎn)運(yùn) 網(wǎng)格蛋白運(yùn)輸小泡,N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶將GlcNAc-Pi加到甘露糖分子上 N-乙酰葡萄糖胺磷酸糖苷酶除去GlcNAc，產(chǎn)生M-6P標(biāo)志,Two enzymes add M6P on lysosomal hydrolases,一種M6P受體： 為鈣依賴(lài)受體M6P受體，也作為胰島素類(lèi)生長(zhǎng)因子的受體。pH7左右時(shí)與M6P結(jié)合，pH小于6則與M6P分離。 （1）Golgi反面膜囊、TGN和前溶酶體(prelysosome)上。 （2）細(xì)胞質(zhì)膜上。分泌到胞外的溶酶體酶多以酶前體形式存在，借助受體介導(dǎo)的胞吞作用(網(wǎng)格蛋白參與)。,前溶酶體（prelysosome）：由載溶酶體酶的轉(zhuǎn)運(yùn)小泡與胞內(nèi)體（endosome）融合形成，又稱(chēng)胞吞溶酶體（e