1、第十二章 液相色譜用填充材料-羥基磷灰石,羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP) -一種膠體磷酸鈣，廣泛存在于人體和牛乳中，人體內(nèi)主要分布于骨骼和牙齒中，牛乳內(nèi)主要分布于酪蛋白膠粒和乳清中。 實質(zhì)上是一種高度交錯聚合的高分子磷酸鈣聚合物，其分子式為 Ca10(PO4)6(OH)2，其中鈣磷元素摩爾比值為1.67。在骨骼和牙齒中，鈣和磷又主要以膠體磷酸鈣結(jié)晶形態(tài)存在，并和膠原蛋白質(zhì)共同構(gòu)成復雜的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。,其材料本是骨骼和牙齒等生物硬組織的主要無機成分,與生物組織有特異性的親和力和相容性。,實驗研究表明，HAP納米粒子對肝癌、胃癌、骨肉瘤等多種癌細胞的生長具有不同程度的抑制作用。,

2、1000元/公斤,膠體磷酸鈣應用范圍較廣，涵蓋乳品、飲料、糖果、烘焙食品及鈣片等各種需要進行鈣強化的食品。 在天然食品中，以鮮奶等乳制品的含鈣量最高，如果完全從這些食品中獲取鈣質(zhì)，最大的問題就是必須攝入大量食物才能得到所需的鈣質(zhì)，同時會攝入大量的熱量和脂肪，因此，攝取高鈣食品是補充鈣質(zhì)的最好方式。 膠體磷酸鈣的鈣含量為24% ，鮮奶一般的鈣含量為 100mg/100ml ，再額外添加 0.1g /100ml 的膠體磷酸鈣，奶制品的成品鈣含量即可達到 120mg/100ml ，達到高鈣牛奶的要求。,一、基本概念,羥基磷灰石是一種弱陽離子或弱陰離子交換層析材料。 優(yōu)點:能精確地分離、純化結(jié)構(gòu)上只有

3、微小差別的生物大分子。,二、HAP的性能,高機械強度:可以耐受15MPa以上壓力,陶瓷HAP可以耐受幾十MPa的壓力。 高柱效:球形HAP顆粒大小、形狀及孔隙大小均適合HPLC的要求，其顆粒及孔徑小，有比較高的柱效。 化學和熱穩(wěn)定性:是磷酸鈣鹽中最穩(wěn)定的,在中性和堿性水相中非常穩(wěn)定,溶解度很低,熱穩(wěn)定性很高,可采用高溫制備方法生產(chǎn)。 低的非可逆性吸附:HAP有非常低的非可逆性吸附。 表面修飾性:HAP表面比較容易進行各種化學修飾。,三、HAP制備方法,（一）通常有干法、水熱法和濕法。 在正常條件下，填料粒度20m時，干法填充制備柱較為合適；顆粒20m時，濕法填充較為理想。 用于色譜的HAP制備

4、以濕法為主。,片狀Tiselius型HAP的制備: 因人而得名，即以鈣鹽或氫氧化鈣與堿金屬磷酸鹽,磷酸銨或磷酸在水溶液中控制反應條件結(jié)晶而成不規(guī)則的片狀晶體。,Ca化合物,P化合物,轉(zhuǎn)型,反應,羥基磷灰石,問題：晶體不規(guī)則易碎顆粒大小波動色譜柱的填充狀態(tài)改變柱效降低重復性變差。 如何解決？,日本人的專利-制造均勻HAP顆粒,以CaHPO4.2H2O晶體顆粒為先導物質(zhì)，在高于其脫水溫度和相變溫度，而不致于發(fā)生分解的條件下加熱，首先脫水相變?yōu)镃aHPO4，然后用堿處理再轉(zhuǎn)變成晶體HAP，它大小較均勻，約1-3um厚，數(shù)微米大小。,2.粒狀HAP的制備: 二次造粒:首先制備HAP微晶（微小針棒狀）,

5、然后采用噴霧法進行造粒(在適當黏結(jié)劑存在下,噴霧干燥HAP微粒懸浮物成為球粒)。,克服易碎-微晶聚集成球形顆粒,Ca化合物,P化合物,造粒 二次粒子：1100um；孔徑：8090nm,反應 一次粒子01um,羥基磷灰石,噴霧熱解技術(shù):硝酸鈣和磷酸的甲醇溶液在8001400oC之內(nèi)高溫噴霧熱解制備球形顆粒。,圖4 不同溫度煅燒HA粉末的TEM照片, (a) 750, (b) 900,(a),(b),（二）制備球形羥基磷灰石的新方法,1.復合球形羥基磷灰石 2.直接合成球形羥基磷灰石,復合成球,晶形轉(zhuǎn)化,薄殼球形HAP,球形HAP,HAP的色譜機理,是一種弱離子交換色譜,實驗結(jié)果表明其對DNA、多

6、肽、蛋白質(zhì)的分離機理合乎離子交換色譜的機理。 HAP的色譜機理可能包括以下幾個方面: 存在兩種不同的吸附晶面; 兩種不同晶面吸附方式不同; 兩種不同吸附點的起因:Ca2+離子和PO43-; 色譜歷程為離子間的競爭過程。,HAP在生化產(chǎn)物分離中的應用,一般應用領(lǐng)域:糖類,多肽,蛋白質(zhì),酶,核糖核酸。 單克隆抗體的分離純化。 結(jié)構(gòu)差異很小的蛋白質(zhì)分離。,問題,HAP是什么原理的色譜?為什么HAP具有比較高的分辯力? HAP色譜填料的主要特點?,第十三章 徑向色譜柱的發(fā)展與應用,傳統(tǒng)色譜存在的問題,放大過程的困難； 保證生物物質(zhì)活性的困難：生物樣品的分離純化過程對環(huán)境的要求較嚴，生物組成成分復雜，分

7、子量較大，比較敏感，增加其使用的難度； 生產(chǎn)效率的問題。,什么是徑向色譜,采用徑向流技術(shù)的色譜,即樣品和流動相沿徑向流動,可以從色譜柱的周圍流向圓心,也可以從圓心流向柱的周圍,通常采用從柱的周圍流向圓心的方式。,徑向色譜技術(shù)的發(fā)展可以追溯到五十年以前, 1947年發(fā)明的借助離心力分離溶液的裝置, 已經(jīng)采用了徑向色譜的原理和方法。,徑向色譜的優(yōu)點,采用徑向流技術(shù),可以在較小的柱床層高度時使用較大的流動相速度。 在較高流動相速度時,反壓降低。 可以線性地增加樣品處理量,樣品可以在完全相同的色譜條件下直接放大。,徑向色譜柱分離介質(zhì),目前徑向色譜柱使用的填料主要有離子交換樹脂和親和色譜兩種。 離子交換

8、色譜使用率最高,其中以二乙基氨基已基(DEAE)為官能團的使用最多,其次為羥甲基(CM)和磷酸(P)。 選擇具高選擇的填料可以克服徑向色譜直徑短的缺點,發(fā)揮徑向色譜柱速度快,處理量大的優(yōu)點。,幾種徑向色譜填料形態(tài)(顆粒,膜,連續(xù)床層),1、膜填料:通過接枝聚合反應獲得的填料再制成膜狀,卷入事先設計好的色譜柱中,使成為徑向色譜柱。 常用：多糖類基質(zhì)上通過接枝聚合反應，以化學共價鍵結(jié)合上有機聚合物，形成一部分具有穩(wěn)定的共價性結(jié)構(gòu)，另一部分則是較軟的聚合物的產(chǎn)物。,2、連續(xù)床層填料:連續(xù)床層填料為一整體,其橫截面有足夠的通道容許流動相和樣品通過色譜柱床層。連續(xù)床孔隙度高,滲透性好,因此適合在高流速下

9、進行分析分離而不會導致過高的反壓。,徑向色譜的傳質(zhì)過程,軸心向柱外圍及柱外圍向軸心的傳質(zhì)過程有差別。 徑向色譜與軸向色譜在傳質(zhì)機制上的不同其中主要原因之一是分子擴散的問題,分子擴散可以忽略的情況下二者傳質(zhì)存在對稱性,以體積坐標表達的方程式完全相同,分子擴散不可忽略時二者不存在這種對應關(guān)系。,徑向色譜的應用,優(yōu)勢：處理量、線性放大。 中試規(guī)模徑向柱與軸向柱經(jīng)濟性比較 相同生產(chǎn)規(guī)模的徑向柱與軸向柱的比較 軸向柱與徑向柱分離凝血劑的回收率比較,徑向色譜的應用,進行人血漿的大規(guī)模分離制備（免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白）。 分離小牛血清（牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白）。 純化鼠抗人尿激酶單克隆抗體。