1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,甘肅中醫(yī)藥大學(xué),MTT法目的和意義,檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)情況 用于評(píng)價(jià)藥物產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用,原理,四唑鹽（噻唑藍(lán)）是一種能接受氫原子的染料，簡(jiǎn)稱MTT 活細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而反映細(xì)胞的增殖情況。 在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。,活細(xì)胞+MTT,琥珀酸脫 氫酶,紫藍(lán)色結(jié)晶物 Formazan,貼壁細(xì)胞操作步驟,1.接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白

2、酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2000-3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積90 ul。 （邊緣孔用PBS或空白培養(yǎng)基填充）。 2.培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板，大約12h），加入濃度梯度的藥物。原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，每孔加藥10 ul，一般設(shè)5個(gè)復(fù)孔。 3. 5%CO2，37孵育分別孵育24小時(shí)后，倒置顯微鏡下觀察。,4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍

3、后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 6. 每孔加入100ul二甲基亞砜（置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。 7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）,懸浮細(xì)胞操作步驟：,1）將細(xì)胞離心收集后，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度大約1104/ml，每孔先加細(xì)胞懸液90ul,相應(yīng)梯度的藥物每孔10ul；共100ul加入到96孔板（邊緣孔用PBS填充）。每板設(shè)對(duì)照。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。 2

4、）置37，5%CO2孵育24小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 4）每孔加三聯(lián)裂解液（10gSDS，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成100ml）過(guò)夜， 第二天早晨置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm測(cè)量各孔的吸光值。,藥物的配制,濃度 體積 過(guò)濾,MTT的配制,MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)

5、就絕對(duì)不能再用了。 MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，因?yàn)闀r(shí)間較短。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)值以xs表示，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，p0.05時(shí)為相差顯著，p0.01時(shí)為相差非常顯著?？梢砸詴r(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線曲線，專門公式求IC50（半數(shù)抑制濃度 ）?；蛴?jì)算抑制率。 OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組 抑制率 % = OD對(duì)照組,100 %,實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,公式如下： lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽(yáng)

6、性反應(yīng)率之和Pm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率Pn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率,舉例,藥物濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計(jì)算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025,注意事項(xiàng),1選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對(duì)每一種

7、細(xì)胞都應(yīng)測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間。2設(shè)空白對(duì)照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問(wèn)題,1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過(guò)滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。,2.

8、藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。 3. 時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。,4.培養(yǎng)時(shí)間。100ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的45次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持68h，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。 5.MTT法只能

9、測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。,7.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。 8.避免血清干擾。用含15胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。,關(guān)于細(xì)胞的接種(鋪板),細(xì)胞過(guò)了30代以后就不要用了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的

10、板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。 接種時(shí)最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種, 且而細(xì)胞過(guò)密或者過(guò)少，增殖都會(huì)過(guò)快或者過(guò)慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。 細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來(lái)定。 懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為103-104。,MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20的波動(dòng)也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過(guò)關(guān)。 注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來(lái)，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過(guò)

11、多也會(huì)影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。,如何清除上清,直接吸出：加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會(huì)吸去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法,懸浮細(xì)胞要離心2500rpm10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板,清除上清時(shí)注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160ul即可)。 翻轉(zhuǎn)倒扣法：可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）23次，比用“吸”的辦法更不容易使細(xì)胞脫離出來(lái)?？梢暂p拍，或者傾斜一點(diǎn)幫助吸液，但前提是細(xì)胞貼壁要比較牢。,加入DMSO,在同一批實(shí)驗(yàn)中最好不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈如果培養(yǎng)液沒(méi)棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測(cè)時(shí)可以盡量去除培養(yǎng)液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul. 加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩510min, 時(shí)間控制盡量嚴(yán)格一點(diǎn),放置時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)影響結(jié)果,值會(huì)偏大,且結(jié)果不可信. 加入DMSO溶解后盡快檢測(cè)。,OD值的測(cè)定,至于測(cè)定波長(zhǎng)的選擇是因顯色溶液而異的。對(duì)于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值