1、2020/7/28,1,液相色譜Liquid chromatography,2020/7/28,2,主要內(nèi)容,概述 色譜過程理論基礎(chǔ) 凝膠層析 離子交換層析 其它層析技術(shù),2020/7/28,3,4色譜理論,兩組份完全分離必須滿足： A、兩組份的分配系數(shù)必須有差異； B、區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速度； C、在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。,2020/7/28,4,?,吸附等溫線,4.1.吸附平衡,當(dāng)吸附劑與溶液中的溶質(zhì)達(dá)到平衡時(shí)，其吸附量q*同溶液中溶質(zhì)的平衡應(yīng)與溫度有關(guān)。 當(dāng)溫度一定時(shí)，吸附量只和濃度有關(guān)，q* = f(c) - 吸附等溫線。,2020/7/28,5,A)、

2、Henry type 在一定溫度下，平衡時(shí)吸附劑吸附溶質(zhì)濃度q*與液相溶質(zhì)濃度c之間的關(guān)系為線性函數(shù)： m為分配系數(shù)。 適應(yīng)條件：在低濃度范圍之內(nèi)成立。當(dāng)濃度較高時(shí)，上式無效。,吸附等溫線類型,2020/7/28,6,B)、Freundlich type 其經(jīng)驗(yàn)公式為 其中，k和為常數(shù)，一般在0.1-1之間。 Freundlich等溫線可以描述大多數(shù)抗生素、類固醇、甾類激素等在溶液中的吸附過程。,2020/7/28,7,C)、Langmuir type S-為表面活性中心。基于上述平衡，及假定單分子層吸附，得Langmuir 型吸附平衡方程 qmax為飽和吸附量，Kb為結(jié)合常數(shù)。當(dāng)n個(gè)分子在一

3、個(gè)活性中心發(fā)生吸附時(shí)，即存在： 此時(shí)有,當(dāng)吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附作用非常大時(shí)，這時(shí)存在 n10，或用前式表示Kb非常大，這時(shí)游離的溶質(zhì)濃度對(duì)吸附濃度影響極小，接近不可逆吸附。,2020/7/28,8,D)、Rectangle type 如在固定化單克隆抗體的免疫親和吸附中，一般存在n 10。,2020/7/28,9,塔板理論的假設(shè)： (1) 在每一個(gè)平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到； (2) 將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過程； (3) 試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略； (4) 每次分配的分配系數(shù)相同。,4.2塔板理論 -柱分離效能指標(biāo)(P128),1.塔板理論（plate theory）,將色譜柱視為精

4、餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板高(plate high)為H。假設(shè)在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前轉(zhuǎn)移。對(duì)一長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為n.,2020/7/28,10,2020/7/28,11,2020/7/28,12,2020/7/28,13,2020/7/28,14,2020/7/28,15,n稱為理論塔板數(shù)(theoretical plate number)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨塔板高H的增大而減小。 n與半峰寬及峰底的關(guān)系式為: 式中tr(或Y1/2)應(yīng)采取同一單

5、位(時(shí)間或距離)。上式示：在tR一定時(shí)，如果色譜峰越窄，則說明n越大，H越小，柱效能越高。,2020/7/28,16,在實(shí)際工作中，按上式計(jì)算出來的n和H值有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因?yàn)椴捎胻R計(jì)算時(shí)，沒有扣除死時(shí)間tM，所以，常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效： 有效塔板高為： 例1 已知某組分峰的峰底寬為40S，保留時(shí)間為400S，計(jì)算此色譜柱的理論塔板數(shù)。,2020/7/28,17,例2 已知一根1米長(zhǎng)的色譜柱的有效塔板數(shù)為1600塊，組份A在該柱上的調(diào)整保留時(shí)間為100秒，試求A峰的半峰寬及有效塔塔板高度。,2020/7/28,18,塔板理論的特點(diǎn)和不足(p129),(1)當(dāng)色譜

6、柱長(zhǎng)度一定時(shí)，塔板數(shù) n 越大(塔板高度 H 越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。,(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。,(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。,(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。,2020/7/28,19,4.3速率理論,1956年，荷蘭學(xué)者范姆特（van Deemter）等人在研究氣液色譜時(shí)，提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論速

7、率理論。他們吸收了塔板理論中塔板高的概念，并同時(shí)考慮影響塔板高的動(dòng)力學(xué)因素，指出：填充柱的柱效受分子擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力、載氣流速等因素的控制，從而較好地解釋了影響塔板高度的各種因素。 譜峰擴(kuò)寬受三個(gè)動(dòng)力學(xué)因素的控制，即渦流擴(kuò)散，分子擴(kuò)散項(xiàng)，傳質(zhì)阻力項(xiàng)。這樣, 上述塔板高方程表示 式中，A、B、C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。由上式知，當(dāng)一定，只有當(dāng)A、B、C較小時(shí)，H才能小，柱效才會(huì)高。反之則柱效低，色譜峰擴(kuò)張。,2020/7/28,20,4.3速率理論 -影響柱效的因素,1. 速率方程（也稱范.弟姆特方程式） H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度，

8、 u：載氣的線速度(cm/s),減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效； 存在著最佳流速； A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？,2020/7/28,21,A渦流擴(kuò)散項(xiàng),A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑 ：固定相的填充不均勻因子,固定相顆粒越小dp，填充的越均勻，A，H，柱效n。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。,（動(dòng)畫）,2020/7/28,22,B/u 分子擴(kuò)散項(xiàng),B = 2 Dg ：彎曲因子，填充柱色譜，1。 Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2s-1） (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散; (2) 擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H(n)，分離變差; (3) 分子擴(kuò)散項(xiàng)與流

9、速有關(guān)，流速，滯留時(shí)間，擴(kuò)散; (4) 擴(kuò)散系數(shù)：Dg (M載氣)-1/2 ； M載氣，B值。,（動(dòng)畫）,2020/7/28,23,k為容量因子； Dg 、DL為擴(kuò)散系數(shù)。 減小介質(zhì)粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。,Cu 傳質(zhì)阻力項(xiàng),傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即： C =（Cg + CL）,（動(dòng)畫）,2020/7/28,24,2.載氣流速與柱效最佳流速,載氣流速高時(shí)： 傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速，柱效。 載氣流速低時(shí)： 分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速,柱效 。,H - u曲線與最佳流速： 由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使

10、得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。 以塔板高度H對(duì)應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。,2020/7/28,25,速率理論的要點(diǎn),(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。,(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。,(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。,(4) 各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影

11、響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。,2020/7/28,26,4.4色譜分離度,柱效n 衡量柱效的指標(biāo)是n(或neff)，柱效則反映了色譜分離過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。 選擇性 為洗脫峰相鄰的兩種溶質(zhì)的容量因子之比. 分離度 右圖是兩相鄰組份在不同色譜條件下的分離情況。a）中兩組份沒有完全分離。b）和c）中兩組份完全分離，前者的柱效雖不高，但選擇性好；后者的選擇性較差，但柱效高。由此可見，單獨(dú)用柱效或柱選擇性并不能真實(shí)地反映組份在色譜柱中的分離情況，所以，在色譜分析中，需要引入分離度(RS)這一概念。,2020/7/28,27,4.

12、4色譜分離度(補(bǔ)充掌握),分離度也稱分辨度。它是指相鄰兩色譜保留值之差與兩峰底寬平均值之比，即 一般來說，當(dāng)Rs 1.5時(shí)，兩峰才能完全分離。當(dāng)然，更大的Rs值，分度效果會(huì)更好，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。 利用上式，可以直接從色譜圖上計(jì)算分離度。但該式?jīng)]有體現(xiàn)影響分離度的諸因素。而下式清楚地指出了，分離度受柱效n、選擇性和容量因子k三個(gè)參數(shù)的控制： 意義,2020/7/28,28,4.4色譜分離度,意義（提高Rs的策略）： 第一，增加塔板數(shù)，可以增加分離度，若通過增加柱長(zhǎng)來增加塔板數(shù)，就會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。所以，設(shè)法降低塔板高H，才是增大分離度的最好方法。 第二，加大容量因子可以增加分離度，但是會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，甚至造成譜帶檢測(cè)困難。一般來說，當(dāng)k1