1、現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)技術(shù),一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是動(dòng)物基因工程在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中的突出成果。 近十年來，為分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、腫瘤研究及優(yōu)良經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的開發(fā)研究等多方面做出了很大的貢獻(xiàn)。,（一）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）是指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。 外源基因隨細(xì)胞分裂分配到所有子細(xì)胞中并遺傳給后代，這種動(dòng)物叫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 嚴(yán)格說，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有別于嵌合體。 嵌合體動(dòng)物（chimeric animal）：只有部分組織細(xì)胞的基因組中整合有外源基因。 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法制備的動(dòng)物第一

2、代均為嵌合體。雄原核顯微注射法制備的動(dòng)物第一代中1-10%為嵌合體（延遲整合）。,Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，得到了帶有這種外源DNA順序TGM。 1982年P(guān)almiter等運(yùn)用此法得到的所謂“超級(jí)巨鼠”,曾引起整個(gè)生物學(xué)界的轟動(dòng)。 到目前為止，人類已獲得轉(zhuǎn)基因魚、鼠、羊、豬、兔、牛等等大小動(dòng)物。 從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學(xué)遺傳、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開發(fā)研究等。,（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法,1、受精卵雄原核顯微注射法 2、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法 3、逆轉(zhuǎn)錄病

3、毒感染法 4、體細(xì)胞核移植法 5、精子載體法 6、YAC法,1、雄原核顯微注射法,以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA直接注射入受精卵的原核，再將接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。 目前應(yīng)用較廣泛，最早最經(jīng)典的方法。,這一方法的實(shí)驗(yàn)程序如下： （1）準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母） （2）受精卵的準(zhǔn)備 （3）基因?qū)?（4）胚胎移植 （5）對(duì)幼鼠的鑒定,Timing of Pre-Implantation events,Oviduct Transfers,Expression of Exogenous Genes,Screening Strategies

4、,Southerns, Induction/Loss of Restriction sites, PCR RT-PCR 測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物活性：ELISA，RIA 其成功率的高低主要取決于受精卵和胚胎發(fā)育的時(shí)間。 基因的整合是隨機(jī)的，多數(shù)插入單一染色體位點(diǎn)中。外源基因的插入會(huì)引起宿主基因的DNA序列重排，缺失，重復(fù)或易位。,外源基因也可不插入呈游離狀態(tài)，以質(zhì)粒形式存在表達(dá)功能并傳給子代，其詳細(xì)機(jī)理現(xiàn)在也不是很清楚。 優(yōu)點(diǎn)： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；導(dǎo)入過程直觀； 整合率高 缺點(diǎn)： 設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多 對(duì)操作人員有較高的技術(shù)要求 低效率（尤其是大家畜） 對(duì)卵子傷害大，胚胎存活率低

5、基因整合隨機(jī)性 轉(zhuǎn)基因沉默,2、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法,ES細(xì)胞是早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細(xì)胞系。 將攜帶有外源基因的ES細(xì)胞注入到動(dòng)物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。 在ES細(xì)胞上的基因操作： 可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔、磷酸鈣共沉淀等方法將外源基因?qū)隕S細(xì)胞。 因此，借用ES細(xì)胞系可將人們企望的某種不完整的、無功能基因直接引入到ES細(xì)胞中，通過細(xì)胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動(dòng)物后代。,Generatin

6、g ES Cells,Screening ES Cell Clones,Retrieval of Blastocysts,Injection of ES cells into blastocysts,優(yōu)點(diǎn)： 外源基因整合情況的可控性高。 可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性。 外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便。 缺點(diǎn)： ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難 維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易 所得個(gè)體為嵌合體 目前，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚。,（三）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特性,整合拷貝數(shù)1-100左右，多拷貝常以首尾相連接的形式存

7、在。 整合是隨機(jī)的。 整合是穩(wěn)定的，可以傳給子代。 外源基因可以在一種組織或多種組織中表達(dá)。 少數(shù)外源基因兩側(cè)序列有重排現(xiàn)象。 基因表達(dá)強(qiáng)弱與拷貝數(shù)無關(guān)，與“位置效應(yīng)”有關(guān)。,（四）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的意義,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是在單細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。而許多基因的表達(dá)是無法通過轉(zhuǎn)染的方法來研究： 基因表達(dá)有時(shí)空與組織的特異性； 外源基因的表達(dá)受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；因此，只有通過轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物才有可能研究基因的表達(dá)、調(diào)控及基因之間的相互作用。 進(jìn)行功能基因組學(xué)的研究，研究外源基因在動(dòng)物整體水平的表現(xiàn)調(diào)控規(guī)律。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型可用來進(jìn)行疾病發(fā)病學(xué)和治療性研究。 也可改變動(dòng)物基因使其表現(xiàn)

8、型更適合人類需要。 還可以用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)一些人類所需的生物活性物質(zhì)。,二、免疫缺陷動(dòng)物 （Immunodeficient animal）,（一）定義： 是指由于先天性遺傳突變或用人工方法。造成一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動(dòng)物。 （二）分類： 1、先天性免疫缺陷動(dòng)物： a. T淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：裸小鼠，裸大鼠 b. B淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：CBA/N小鼠 c. NK細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：Beige小鼠 d. 聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物：SCID小鼠等 2、獲得性免疫缺陷動(dòng)物：猴、小鼠、貓等AIDS模型,（三）裸小鼠（Nude Mice）,1、發(fā)現(xiàn)與發(fā)展,1962年英國格拉斯哥醫(yī)院Grist在非近交系

9、的小鼠中偶然發(fā)現(xiàn)有個(gè)別小鼠無毛。 1966年證實(shí)是由于第11對(duì)染色體基因突變所致。 1968年，Pantelouris解剖發(fā)現(xiàn)裸鼠失去了正常的胸腺。 由于裸鼠原種抵抗力差，生育力低，壽命短，不能用于實(shí)際。和純系BALB/C，C3H，C57BL/6小鼠交配，不斷選育，獲得了三種近交系鼠（Inbred Nude Mice）新種。 1969年Rygaard首先將人結(jié)腸腺癌移植裸小鼠獲得成功。 裸鼠自發(fā)現(xiàn)以來，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和病毒學(xué)等多個(gè)學(xué)科的研究。,2、生物學(xué)特點(diǎn),（1）一般特點(diǎn) 純合子突變裸鼠（nu/nu）主要表現(xiàn)為無毛以及胸腺缺陷。雜合子小鼠（nu/+）各方面表現(xiàn)正常。 體重小于同齡普

10、通鼠，發(fā)育緩慢。 必須養(yǎng)育在SPF環(huán)境中 。 繁殖方式：一般采用隱性純合子雄性與雜合子雌鼠交配（nu/nunu/+）。,（2）解剖生理特點(diǎn),胸腺殘留一些上皮樣細(xì)胞；淋巴組織胸腺依賴區(qū)的淋巴細(xì)胞消失；外周血淋巴細(xì)胞減少。 雖然有原始的T細(xì)胞，但缺乏成熟的T細(xì)胞。T細(xì)胞的輔助，抑制及殺傷功能不全。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中無有絲分裂反應(yīng)，對(duì)刀豆素A或植物凝集素P無促分裂原應(yīng)答。 無接觸敏感性，無移植排斥，無移植物 抗宿主反應(yīng)。 B細(xì)胞數(shù)量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要是IgM，只有少量IgG。 粒細(xì)胞功能較低，NK細(xì)胞活性高。,BALB/c-nu的胸腺,昆明小鼠的胸腺,3、裸鼠的應(yīng)用,裸鼠在腫瘤

11、研究上的應(yīng)用：制作人類腫瘤移植瘤模型 人類腫瘤移植于動(dòng)物的歷史 免疫排斥問題 眼前房，腦內(nèi)，地鼠的頰囊等免疫逃避部位 免疫抑制劑、射線照射的使用 裸鼠作為人類腫瘤受體,腫瘤移植瘤模型在腫瘤基礎(chǔ)研究中的意義 添加人為因子（致突變劑，癌基因，藥物等）觀察腫瘤 病因及機(jī)理和治療。 建立腫瘤細(xì)胞株：提供大量腫瘤組織供分析。 診斷和預(yù)后：建立平行模型，明確診斷和 跟蹤預(yù)后。 個(gè)體化療有效試驗(yàn)：對(duì)于晚期和復(fù)發(fā)腫瘤有重要意義。 藥物有效的標(biāo)準(zhǔn)：1.腫瘤不生長(zhǎng)；2.腫瘤生長(zhǎng)緩慢；3.腫 瘤長(zhǎng)出后又消失；4.腫瘤無轉(zhuǎn)移；5.動(dòng)物壽命延長(zhǎng)。,腫瘤移植瘤模型制作方法,腫瘤組織塊或腫瘤細(xì)胞皮下移植 腹腔內(nèi)或腎包膜下移

12、植 原位移植,移植瘤模型成功制作的影響因素：,腫瘤組織： 惡性程度：惡性和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)瘤成功率較高 種類：細(xì)胞系成功率活檢標(biāo)本 來源：淋巴瘤、骨腫瘤等難獲成功 部位：腫瘤塊的外周部接種易成活 裸鼠： 遺傳背景：胰腺癌接種BALB/c 成功，NIH系失敗 性別：雌激素依賴性腫瘤接種雄鼠生長(zhǎng)慢 鼠齡：4-6周 動(dòng)物健康狀態(tài),接種部位：原位移植成功率高，移植腫瘤與人類原發(fā)瘤相似。有些腫瘤需要接種在特定的部位（對(duì)雌激素依賴的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，接種乳腺脂肪墊才能成活）。 其他：環(huán)境：細(xì)菌病毒可以影響NK細(xì)胞活性；接種時(shí)間越早越好，注意無菌操作。 （2）裸鼠在醫(yī)學(xué)其他領(lǐng)域的應(yīng)用： 免疫學(xué)：研究體液免疫

13、與細(xì)胞免疫的關(guān)系，研究免疫相關(guān)疾病 寄生蟲：寄生蟲感染的動(dòng)物模型，美洲錐蟲，卡氏肺囊蟲 皮膚：魚鱗病 免疫缺陷模型：麻風(fēng)，結(jié)核,（四）嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠 （Sever Combined Immunodeficient Mice, SCID mice）,1983年Bosma首次報(bào)告，來源于C.B-17小鼠。 由于第16對(duì)染色體隱性基因突變，純合突變導(dǎo)致淋巴細(xì)胞抗原受體基因VDJ區(qū)域重排的重組酶活性異常，基因重排時(shí)斷裂無法正常連接，從而影響B(tài)、T細(xì)胞的正常功能分化。 1988年我國醫(yī)科院動(dòng)物所從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)；1992年我校從澳大利亞引進(jìn)。,1、生物學(xué)特點(diǎn)：,外觀體重與普通小鼠相同

14、。 繁殖特點(diǎn)：純合子兄妹交配。 對(duì)鼠肝炎，巴氏桿菌、卡氏肺囊蟲極易感染，感染后易發(fā)病死亡。必須養(yǎng)育在SPF環(huán)境中，平均壽命1年以上。 2、組織解剖學(xué)特點(diǎn)： 脾臟、胸腺、淋巴結(jié)體積低于普通小鼠的30%，淋巴組織缺乏淋巴細(xì)胞。（胸腺殘留上皮樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，脾臟沒有脾小體，白髓缺限，紅髓正常，淋巴結(jié)由網(wǎng)狀細(xì)胞構(gòu)成。） 外周血白細(xì)胞總數(shù)減少，淋巴細(xì)胞占1020%，非淋巴性造血細(xì)胞如粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞正常，NK、LAK細(xì)胞正常。,3、免疫功能特點(diǎn)：,沒有B、T 陽性標(biāo)志細(xì)胞，對(duì)外來抗原無細(xì)胞和體液免疫。NK、LAK細(xì)胞功能正?；蛟龈?；肥大細(xì)胞因缺乏T細(xì)胞因子而分化受阻。 約2-23%的SCID小鼠在青年期B、T細(xì)胞功能可以恢復(fù)，稱為滲漏（Le