1、熒光原位雜交技術(shù)及其臨床應(yīng)用,熒光原位雜交（FISH） 將分子帶進(jìn)細(xì)胞遺傳學(xué)的領(lǐng)域,熒光原位雜交技術(shù),90 年代以后, 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的提高以及向各學(xué)科的滲透, 出現(xiàn)了一種新的運(yùn)用分子手段分析染色體異常的方法, 即: 染色體熒光原位雜交( FISH) 技術(shù), 該技術(shù)不僅可用于中期分裂相, 還可在間期細(xì)胞顯示雜交信號(hào), 尤其適用于那些培養(yǎng)難以成功的各種組織細(xì)胞。,由細(xì)胞到DNA分子,熒光原位雜交技術(shù)的基本概念,1.脫氧核糖核酸(DNA)分子 2.脫氧核糖核酸(DNA)探針 3.脫氧核糖核酸(DNA)變性 4.脫氧核糖核酸(DNA)雜交,熒光原位雜交原理,FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核

2、酸 為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未 知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的 雜交雙鏈核酸。,熒光原位雜交技術(shù),熒光原位雜交技術(shù)（簡(jiǎn)稱FISH）是用細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的原理，通過(guò)熒光標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)的核酸序列雜交。借助熒光顯微鏡，在細(xì)胞和（或）組織中觀察并分析細(xì)胞內(nèi)雜交于靶序列的多種彩色探針信號(hào)，以獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體或多種基因狀態(tài)的信息。,熒光原位雜交示意圖,常見(jiàn)的熒色物,熒光顯微鏡系統(tǒng),探針的標(biāo)記的種類及比較,1.探針標(biāo)記方法主要有兩類： （1）直接標(biāo)記法，就是熒光素通過(guò)一些方法直接連接到核酸序列上。 （2）間接標(biāo)記法，就是把地高辛或生物素等半抗原連接到核酸序列 ，

3、然后在雜交過(guò)后的檢測(cè)階段，加入標(biāo)記有熒光素的相應(yīng)半抗原抗體參與反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。,探針的標(biāo)記的種類及比較,2. 這兩種標(biāo)記方法相比較而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低，信號(hào)強(qiáng)度不及間接法強(qiáng)；間接法具有信號(hào)放大系統(tǒng)，信號(hào)強(qiáng)檢測(cè)靈敏度高，但是間接法雜交過(guò)后檢測(cè)步驟繁瑣，背景信號(hào)強(qiáng)。近年來(lái)熒光的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高, 直接標(biāo)記的熒光探針越來(lái)越成為首選, 并采用多種不同顏色的熒光, 方便在同一標(biāo)本上同時(shí)檢測(cè)多種異常. 其熒光強(qiáng)度和信號(hào)大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察, 操作過(guò)程中也不需要嚴(yán)格避光, 鑒于直接標(biāo)記法已經(jīng)可以獲得較滿意的信號(hào)，目前臨床檢測(cè)用的探針多為直接標(biāo)記法標(biāo)記。,臨床常用的探

4、針,臨床使用的探針都是以DNA 為主。 常用探針主要有： （1）著絲粒探針。 CEP:Chromosome Enumeration DNA Probes （2）位點(diǎn)特異型探針。 LSI :Locus specific identifier （3）染色體涂染探針。 WCP: Whole Chromosome Paints,著絲粒探針,a. 高度重復(fù)序列DNA ,重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次，其靶序列通常是在染色體的p11-q11區(qū)域及異染色質(zhì)區(qū)域。b. 特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng) c. 應(yīng)用 (a)標(biāo)記染色體識(shí)別。 (b)染色體數(shù)目異常檢測(cè)。 (c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷。,著絲粒探針,染色體的著絲粒,異染色質(zhì)域

5、,位點(diǎn)特異型探針,a . 標(biāo)記了熒光信號(hào)的DNA片段代表了某一個(gè)或幾個(gè)基因位點(diǎn)的全部序列。主要用以染色體DNA 克隆序列的定位和靶DNA 序列拷貝數(shù)及結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)。 b. 特點(diǎn)：信號(hào)較小。 c. 應(yīng)用: （a）定位DNA片段。 （b）確定染色體微小缺失與重復(fù)。 （c）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。,16號(hào)和22號(hào)染色體探針信號(hào),位點(diǎn)特異型探針,染色體涂染探針,a. 涂染探針是針對(duì)某一整條染色體設(shè)計(jì)探針，涂染探針主要用于常規(guī)顯帶技術(shù)無(wú)法確定的染色體重排和標(biāo)記染色體的確定。能對(duì)整條染色體進(jìn)行熒光標(biāo)記 b. 特點(diǎn)：結(jié)果容易判讀。然而，整條染色體涂染 探針不能分辨同一染色體臂間易位及染色體倒位。 c.

6、 應(yīng)用： （1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析。 （2）白血病及其它腫瘤的染色體診斷 和研究。,染色體涂染探針：染色體結(jié)構(gòu)異常分析,FISH技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟,1）備制玻片 2）標(biāo)本變性 3）探針變性 4）雜交 5）DAPI復(fù)染 5）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果,羊水標(biāo)本采集,a. 在B 超腹部探頭引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺，抽 取羊水20ml，其中15ml 用于常規(guī)羊水細(xì)胞培 養(yǎng), 5ml用于FISH 檢測(cè)。,未培養(yǎng)羊水細(xì)胞制片,取羊水5ml， 1800rpm 離心棄上清，加1mg /ml Hanks 膠原酶B 5ml，37 水浴30 min，1800rpm 離心去上清，加0. 075M KCl 5ml，

7、37 水浴低滲20min，加甲醇: 乙酸= 3 1固定液2ml 預(yù)固定， 1800rpm 離心去上清，加5ml 固定液輕輕混勻，固定10min，1800rpm 離心去上清，再重復(fù)固定1 次，制成細(xì)胞懸液，滴片備用。,雜交前預(yù)處理,將玻片于2 SSC 溶液中浸泡10min，然后放入0.1MHCl 浸泡10min，再放入2 SSC 溶液中浸泡5min，然后放入預(yù)熱到37的 0. 01MHCl( 放入玻片前， 0. 01MHCl 中預(yù)先加入20mg /ml 胃蛋白酶160l) 中消化8 10min，經(jīng)過(guò)2 SSC 溶液再次浸泡5min 后，用70%、85%、100%乙醇中梯度脫水，每次3min，自然

8、晾干， 56烤片2min。,標(biāo)本的變性,玻片置73變性液( 70% 甲酰胺) 中 5min，然后分別置于 20的70%、85%、 100% 冰乙醇中各脫水各3min，自然晾干， 45 50烤片。,探針變性,按照比例( 雜交緩沖液: 探針: 水= 7 2 1) 混合，離心1 3s，73 變性5min，45 50 放置5 10min。(允許FISH探針和目標(biāo) DNA同時(shí)聯(lián)合變性),雜交,將10l 探針置于雜交區(qū)內(nèi)，覆蓋蓋玻 片，封片膠封邊，置保濕盒恒溫42雜交 10 16h。,洗脫,拆片，在46水浴中， 50% 甲酰胺/ 2 SSC 液洗滌3 次，每次7min; 2 SSC 液 洗滌10min;

9、0. 1% np 40 /2 SSC 洗滌5min。 室溫70%乙醇洗滌3min，暗處自然晾干。,DAPI 染色和熒光鏡檢,DAPI 染色和熒光鏡檢: 每片加DAPI 10l，蓋上蓋玻片，染色15 20min，結(jié)果用 熒光顯微鏡觀察，選擇背景干凈、雜交信號(hào)清晰 形態(tài)圓形或近于圓形的細(xì)胞記數(shù)，并照像。,臨床實(shí)驗(yàn)中FISH 結(jié)果判別,每張羊水玻片至少計(jì)數(shù)50 個(gè)細(xì)胞，判斷 標(biāo)準(zhǔn)為: 若正常細(xì)胞數(shù)90% 則判為正常，若 異常細(xì)胞數(shù)60% 則判為異常，若異常細(xì)胞數(shù) 大于15%并且小于60%，則需要重新檢測(cè)并加 倍計(jì)數(shù)到100 以上。,FISH 檢測(cè)結(jié)果,采用雙色13 /21 號(hào)染色體熒光探針檢測(cè) 13

10、 號(hào)、21 號(hào)染色體正常胎兒可見(jiàn)2個(gè)綠色熒光信號(hào)和2 個(gè)紅色熒光信號(hào)。,FISH 檢測(cè)結(jié)果,13 號(hào)染色體正常可見(jiàn)2個(gè)綠色熒光信號(hào)，21 號(hào)染色體三體胎兒可見(jiàn)3 個(gè)紅色熒光信號(hào)。,FISH用于產(chǎn)前診斷主要探針,染色體數(shù)目異常是臨床上最主要的染色體病，其中13號(hào)、18 號(hào)、21 號(hào)、X、Y 染色體數(shù)目異常最為常見(jiàn)， 由于13，18，21，X 和Y 這5 種染色體的非整倍體異常約占所有染色體異常的6580，占染色體異常導(dǎo)致出生缺陷的8595， 因此FISH 用于快速產(chǎn)前診斷主要是針對(duì)這5 種染色體設(shè)計(jì)使用熒光標(biāo)記的探針。,FISH 用于產(chǎn)前診斷的指征,a.妊娠婦女血清學(xué)篩查 風(fēng)險(xiǎn)高危者（大于等于1

11、/270)及臨界風(fēng)險(xiǎn)者 (小于1/270至大于等于1/1000）。 b.妊娠婦女到預(yù)產(chǎn)期時(shí)高齡年齡35 歲。 c.雙親之一為易位攜帶者。 d.不良孕產(chǎn)史。 e.超聲檢查胎兒異常者。,FISH敏感度和特異度均較高,FISH 用于產(chǎn)前診斷檢測(cè)的敏感度和特異度均較高。 例1. 有報(bào)道FISH 檢測(cè)4 500 例未培養(yǎng)羊水細(xì)胞，對(duì)于常染色體的敏感度為92.6%，特異度為100；性染色體敏感度為100，特異度為99.9%。 例2. Tepperberg 等總結(jié)美國(guó)25 個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用FISH 檢測(cè)5 348 例羊水資料，結(jié)果敏感度為99.6%，特異度為99.98%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為99.8%，陰性預(yù)測(cè)值為99

12、.96%。 例3. Caine 等回顧性分析24 742 例FISH檢測(cè)羊水間期細(xì)胞的敏感度為99.54%，特異度為99.97%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為99.54%，陰性預(yù)測(cè)值為99.97%； 由此可見(jiàn)，F(xiàn)ISH 用于快速產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性較高。,FISH產(chǎn)前診斷技術(shù)臨床應(yīng)用,染色體數(shù)目異常是引起新生兒先天性遺傳病的主要因素之一。傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)、染色體核型分析是宮內(nèi)產(chǎn)前診斷胎兒染色體疾病的主要方法, 但該方法所需時(shí)間長(zhǎng)、技術(shù)難度大、易受培養(yǎng)條件的影響。對(duì)未經(jīng)培養(yǎng)的羊水間期細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交檢測(cè), 快速診斷胎兒常見(jiàn)的三體型及性染色體數(shù)目異常, 具有快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。,FISH產(chǎn)前診斷技

13、術(shù)臨床應(yīng)用價(jià)值,正常情況下羊水失敗率約為0.5%， 超過(guò)妊娠24 周后培養(yǎng)失敗率升至10%。FISH 檢測(cè)的成功率2002 年后陸續(xù)有大樣本研究報(bào)道了較為一致的成功率，約為95%98。后隨著商品化探針的上市，操作程序規(guī)范化后失敗率大大降低。傳統(tǒng)核型分析最少需要15 mL 羊水標(biāo)本，而FISH 只需35 mL 羊水。,FISH產(chǎn)前診斷技術(shù)在國(guó)外應(yīng)用,FISH 技術(shù)最先在美國(guó)用于產(chǎn)前診斷，而到2000 年鑒于FISH 技術(shù)具有高度的敏感性和特異性，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)（ ACMG ）宣布FISH 技術(shù)可以用于常見(jiàn)染色體數(shù)目異常的確診。此后，F(xiàn)ISH 技術(shù)在一些發(fā)達(dá)國(guó)家被廣泛用于快速產(chǎn)前診斷。檢測(cè)結(jié)果一

14、般可以在2448 h 就可以獲得，且檢測(cè)結(jié)果與核型分析結(jié)果的一致性可以達(dá)到99.5以上。,產(chǎn)前診斷技術(shù)臨床應(yīng)用價(jià)值,在過(guò)去30 年中視核型分析為產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。FISH 技術(shù)與核型分析相比，可快速得到結(jié)果，該優(yōu)勢(shì)能彌補(bǔ)其在診斷準(zhǔn)確性方面的欠缺，特別是隨著FISH 探針的商品化及實(shí)驗(yàn)方法日臻完善，F(xiàn)ISH 的可靠性逐步證實(shí)，間期細(xì)胞核FISH 技術(shù)可以提供可靠的產(chǎn)前診斷結(jié)果，結(jié)果直觀且便于解釋，滿足了臨床的需要，有利于臨床決策和減輕孕婦過(guò)于焦慮的情緒。,FISH 與母源細(xì)胞污染,羊膜腔穿刺時(shí)母源細(xì)胞污染可影響標(biāo)本質(zhì)量，導(dǎo)致誤診發(fā)生。建議發(fā)生嚴(yán)重母血污染時(shí)不要進(jìn)行FISH 檢測(cè)。影響FISH

15、 結(jié)果的母體細(xì)胞來(lái)源羊膜腔穿刺中母體的淋巴細(xì)胞， 這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不會(huì)生長(zhǎng)。出現(xiàn)母體細(xì)胞污染的原因很大程度上與臨床標(biāo)本采集時(shí)操作有關(guān)。因此臨床羊膜腔穿過(guò)程中應(yīng)盡量避開胎盤穿刺，對(duì)最初抽出的24 mL 羊水改行其他檢測(cè)。,稽留流產(chǎn)與染色體異常,孕早期胚胎染色體異常是稽留流產(chǎn)最重 要的原因的原因之一，自然流產(chǎn)中胚胎染色體異 常占50%左右，而胚胎染色體數(shù)目異常，包括整 倍體和非整倍體，為其發(fā)生的重要因素。,FISH應(yīng)用于流產(chǎn)胚胎絨毛,絨毛染色體檢查是診斷胎兒染色體異常的可靠依據(jù)。由于絨毛染色體制備成功率易受其取材時(shí)間及標(biāo)本質(zhì)量的影響，常造成標(biāo)本分裂相少或染色體形態(tài)不佳等狀況，給診斷帶來(lái)困難。而

16、FISH 分析無(wú)需作細(xì)胞培養(yǎng)及顯帶分析，僅作細(xì)胞計(jì)數(shù)，其優(yōu)勢(shì)是不僅適用于分裂中期的染色體，也適用于間期核及細(xì)胞周期的所有階段。,FISH應(yīng)用于流產(chǎn)胚胎絨毛,選用13、16、18、21、22、X和Y染色體上 的探針對(duì)未培養(yǎng)的絨毛組織進(jìn)行熒光原位雜交來(lái)診 斷染色體異常，雜交信號(hào)明亮,敏感度高,特異性 強(qiáng)，克服了流產(chǎn)絨毛組織易污染導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)不成 功，核型分析困難等導(dǎo)致結(jié)果難出的尷尬局面。,FISH應(yīng)用于流產(chǎn)胚胎絨毛,胎兒自身的遺傳學(xué)異常才是導(dǎo)致早期流產(chǎn)的主要原因，絨毛染色體FISH分析可對(duì)自然流產(chǎn)的原因及時(shí)作出遺傳學(xué)方面的判斷，尤其是對(duì)高危因素的流產(chǎn)絨毛常規(guī)行染色體FISH檢測(cè)是有必要的。對(duì)習(xí)慣性

17、自然流產(chǎn)的高危因素及其臨床絨毛染色體的分析研究，不僅能夠?yàn)榛袅鳟a(chǎn)的病因?qū)W研究提供理論依據(jù)，而且對(duì)患者再次妊娠的治療也具有指導(dǎo)作用，因此開展流產(chǎn)胚胎絨毛組織的FISH染色體檢查是相當(dāng)有意義的。,流產(chǎn)胚胎絨毛FISH圖,16號(hào)染色體探針信號(hào)三個(gè)（綠色） 22號(hào)染色體探針信號(hào)三個(gè)（紅色）,流產(chǎn)胚胎絨毛FISH圖,13號(hào)染色體探針信號(hào)三個(gè)（綠色） 21號(hào)染色體探針信號(hào)三個(gè)（紅色）,流產(chǎn)胚胎絨毛FISH圖,18號(hào)染色體探針信號(hào)2個(gè)（藍(lán)色） X染色體探針信號(hào)1個(gè)（綠色） Y染色體探針信號(hào)1個(gè)（紅色）,FISH技術(shù)在外周血臨床應(yīng)用,傳統(tǒng)核型分析可發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)量異常和長(zhǎng)度達(dá)5 Mb10Mb 的結(jié)構(gòu)性異常。因此傳統(tǒng)核型分析已經(jīng)到達(dá)了檢測(cè)的極限。,FISH技術(shù)在外周血臨床應(yīng)用,FISH 與常規(guī)的染色體顯帶分析法相比, 快速、不需體外培養(yǎng)、在極短的時(shí)間內(nèi)分析的細(xì)胞數(shù)目比常規(guī)染色體分析數(shù)目多10 倍，更容易檢測(cè)出嵌合體類型，做出的結(jié)論更加準(zhǔn)確。還可輔助及確定對(duì)一部分顯帶染色體技術(shù)不易分辨的