考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量.ppt_第1頁
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1、考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量,實驗?zāi)康?了解考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)的原理 掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的操作步驟,實驗原理,考馬斯亮藍G250在酸性的溶液中游離狀態(tài)呈紅褐色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍色，其最大吸收波長由465nm轉(zhuǎn)變?yōu)?95nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，595nm處的光密度值與蛋白質(zhì)濃度成反比，可用比色法進行蛋白質(zhì)定量測定。,儀器和試劑,1儀器：分析天平；吸管0.1ml1、1ml2、5ml1；試管10個；722型分光光度計；容量瓶100ml、1000ml各一個； 2試劑： （1）0.9% NaCl溶液； （2）標準蛋白質(zhì)溶液：稱取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至

2、100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考馬斯亮藍G-250（0.01%）染液：稱取0.1g考馬斯亮藍G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液不宜久存，在常溫中可放置1-2個月。 （4）樣品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用0.9% NaCl溶液稀釋至一定濃度。,操作步驟,10100gmL標準曲線的制作： 取6支試管，編號后，按下表加入試劑，混勻，室溫靜置5min后，以管1為空白對照，在595nm下比色測定。以標準蛋白質(zhì)含量（g）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪出標準曲線。,2樣品中蛋白質(zhì)含量的測定

3、另取兩支干凈的試管（做一重復(fù)），加入合適濃度的待測樣品，使其測定值在標準曲線的范圍內(nèi)，測定方法同上，由樣品液的吸光度查標準曲線即可求出含量。,計算,樣品的蛋白質(zhì)含量（g/g鮮重）=查得的蛋白質(zhì)含量（g） / 樣品鮮重（g）,注意事項,1. 如果要求嚴格，最好在試劑加入后的520min內(nèi)測定光吸收，因為這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。 2測定中，蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。,思考題,1 說出你所知道的幾種蛋白質(zhì)定量測定的方法，并與考馬斯亮藍染色法相比較各有何優(yōu)缺點？ 2根據(jù)下列所給的條件和要求，選擇一種或幾種常用的方法測定蛋白質(zhì)的濃度。 （1）樣品不易溶解，但要求結(jié)果較準確；

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