1、2.6 蛋白質(zhì)的分離、純化,研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。 (1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞； (2)隨時測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白質(zhì)含量。 (3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進(jìn)行。,一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則,(1)生物組織的機(jī)械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。 (2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。 水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。 (3)粗提: 離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。 (4)精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)

2、行精制。 (5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。,蛋白質(zhì)的分離步驟,四、蛋白質(zhì)的純化方法,根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時，蛋白質(zhì)會發(fā)生沉淀作用(Precipitation)。 因為蛋白質(zhì)分子量大小不同、表面所代電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質(zhì)分離出來。 沉淀法具有部分純化、濃縮特點。,(1)沉淀法,蛋白質(zhì)的純化方法,蛋白質(zhì)的純化方法,蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，由于水化層被破壞和表面電荷被中和，容易發(fā)生沉淀 陰離子化合物的效果是：NH4+K+Na+ 陽離子化合物的效果是：PO43-SO42-Cl- 常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶

3、的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。,(1)沉淀法,鹽析,蛋白質(zhì)的純化方法,在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶的有機(jī)溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強(qiáng)，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。為了防止蛋白質(zhì)在分離過程中發(fā)生變性，有機(jī)溶劑濃度不能太高(30%-50%)，而且需要在低溫條件下進(jìn)行。 5，25乙醇沉淀卵清蛋白。,(1)沉淀法,有機(jī)溶劑沉淀法,蛋白質(zhì)的純化方法,蛋白質(zhì)分子在等電點時，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物溶液的pH 被調(diào)到某一成分的等電

4、點時，則該蛋白質(zhì)大部或全部將沉淀出來。而那些等電點高于或低于該pH 的蛋白質(zhì)仍然留在溶液中。 該法適用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。,(1)沉淀法,等電點沉淀法,蛋白質(zhì)的純化方法,Dialysis此法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等分離。 常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為一萬。,（2）膜分離法, 透析法,蛋白質(zhì)的純化方法,透析是將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常是蒸餾水或緩沖液）中進(jìn)行透析。 通透動力為半透膜兩側(cè)的物質(zhì)濃度差。,（2）膜分離法, 透析法,蛋白質(zhì)

5、的純化方法,超過濾技術(shù)是在一定的密封容器，施加一定壓力使一定分子量的物質(zhì)透過超濾膜。 其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式超濾器板式超濾器。,（2）膜分離法,超過濾法,蛋白質(zhì)的純化方法,離子交換層析法,（3）層析法,蛋白質(zhì)的純化方法,此法又稱為分子篩層析（gel-filtration chromatography） 。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 Sephadex-葡聚糖凝膠G10-G200 Sepharose-瓊脂糖凝膠2B,4B,6B Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400,凝膠過濾法,

6、（3）層析法,分子篩層析（gel-filtration chromatography）,原理,基質(zhì) 葡聚糖凝膠（sephadex） 瓊脂糖凝膠（sepharose）,應(yīng)用 測定分子量 : lgMr=a-bVe 脫鹽和濃縮 分離提純生物大分子,這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力。 選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中。 當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性

7、結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。,親和層析法,（3）層析法,親和層析（affinity chromatography）,應(yīng)用 分離純化酶、 抗原、抗體 分離純化核酸 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能,原理：,基質(zhì) 纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、 sepharose、sephadex,蛋白質(zhì)的純化方法,在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)溶液的pH值不等于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。由于不同蛋白質(zhì)的分子量不同，所帶的電荷不同，因而在電場中移動的速度也不相同。 在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（v）取決于電場強(qiáng)度(E)，所帶

8、的凈電荷(q)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(f)。,（4） 電泳法,蛋白質(zhì)的純化方法,SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約1 2比例結(jié)合。 這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。 用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。,（4） 電泳法,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法,離心技術(shù),1離心機(jī)類別 普通離心機(jī) 6000轉(zhuǎn)/分 高

9、速離心機(jī) 2-3萬轉(zhuǎn)/分 超速離心機(jī) 3萬轉(zhuǎn)/分,2沉降系數(shù)（S）概念,沉降系數(shù)（S）,生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時間。其單位用Svedberg，即S表示，S=110-13秒。,沉降系數(shù)（S）與分子量（M）的關(guān)系,Svederg方程:,五、 蛋白質(zhì)含量的測定,定氮法：靈敏度較低 雙羧脲法：樣品量0.2-1.7mg/L Folin-Lowry法：在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，將其與雙羧脲法結(jié)合起來，蛋白質(zhì)形成兩種顏色的混合物老綠色，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高25g-250g/ml.,考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）考馬斯亮藍(lán)G250是一種帶有負(fù)電荷的染料，在酸性條件下，可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，形成藍(lán)色化合物，在595nm具有特定吸收，反應(yīng)簡便、快速、靈敏度高，5-50 g/ml。,紫外吸收法 由于核酸在260nm具有光吸收，對測定干擾較大，可采用280nm、260n