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G

中華人民共和國(guó)中華人民共和國(guó)國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)家標(biāo)準(zhǔn)

GB29693—2013

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

動(dòng)物性食品中常山酮?dú)埩袅康臏y(cè)定

高效液相色譜法

DeterminationofHalofuginoneresidueinanimalderivedfood

byHighPerformanceLiquidChromatographicmethod

（電子版本僅供參考，以標(biāo)準(zhǔn)正式出版物為準(zhǔn)）

2013-09-16發(fā)布2014-01-01實(shí)施

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

發(fā)布

I

目目次次

目次.........................................................................I

前言........................................................................II

動(dòng)物性食品中常山酮?dú)埩袅康臏y(cè)定高效液相色譜法.................................１

1范圍........................................................................１

2規(guī)范性引用文件..............................................................１

3原理........................................................................１

4試劑和材料..................................................................１

5儀器和設(shè)備..................................................................２

6樣品的制備與保存............................................................３

6.1樣品的制備.................................................................３

6.2樣品的保存.................................................................３

7測(cè)定步驟...................................................................３

7.1提取......................................................................３

7.2凈化......................................................................３

7.3空白添加標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備....................................................３

7.4測(cè)定......................................................................４

7.5空白試驗(yàn)..................................................................４

8結(jié)果計(jì)算和表述.............................................................４

9檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度.............................................５

9.1靈敏度.....................................................................５

9.2準(zhǔn)確度.....................................................................５

9.3精密度.....................................................................５

附錄A........................................................................６

II

前前言言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)系國(guó)內(nèi)首次發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

１

動(dòng)物性食品中常山酮?dú)埩袅康臏y(cè)定

高效液相色譜法

1范圍范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物性食品中常山酮?dú)埩袅繖z測(cè)的制樣和高效液相色譜測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于雞的肌肉和肝臟組織中常山酮?dú)埩袅康臋z測(cè)。

2規(guī)范性引用文件規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有

的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方

研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法

3原理原理

試料中殘留的常山酮，用胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，液液萃取，HLB柱凈化，高效液相色譜

-紫外測(cè)定，外標(biāo)法定量。

4試劑和材料試劑和材料

以下所用試劑，除特殊注明外均為分析純?cè)噭?，水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

4.1氫溴酸常山酮對(duì)照品：含量≥99.6%。

4.2甲醇：色譜純。

4.3乙酸乙酯：色譜純。

4.4乙腈：色譜純。

4.5無(wú)水碳酸鈉

4.6胰蛋白酶1000U/mg

4.7乙酸銨

4.8乙酸

２

4.9甲苯

4.10HLB固相萃取柱：500mg/6mL，或相當(dāng)者。

4.110.25mol/L乙酸銨緩沖液：取乙酸銨19.27g，加乙酸30mL，用水溶解并稀釋至1000mL，用

乙酸調(diào)pH至4.3。

4.120.125mol/L乙酸銨緩沖液：取0.25mol/L乙酸銨緩沖液500mL，用水溶解并稀釋至1000mL。

4.1310％碳酸鈉溶液：取無(wú)水碳酸鈉10g，用水溶解并稀釋至100mL。

4.14流動(dòng)相：取乙腈250mL、0.25mol/L乙酸銨緩沖液150mL和水600mL，混勻，用冰乙酸調(diào)pH

至4.3，濾膜過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.15200μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱(chēng)取氫溴酸常山酮標(biāo)準(zhǔn)品10mg，于50ml棕色量瓶中，用

0.25mol/L乙酸銨緩沖液溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為200μg/mL的常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液。密封，

用鋁箔包裹，2～8℃避光保存，有效期6個(gè)月。

4.1610μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密量取200μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.5mL于10mL棕色量瓶

中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液。密封，用鋁箔包裹，2～8℃

避光保存，有效期為6個(gè)月。

5儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備

5.1高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器。

5.2分析天平：感量0.00001g。

5.3天平：感量0.01g。

5.4離心機(jī)

5.5均質(zhì)機(jī)

5.6渦旋振蕩器

5.7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

5.8氮吹儀

5.9固相萃取裝置

5.10恒溫水浴箱

5.11濾膜：0.45μm。

３

6試料試料的制備與保存的制備與保存

6.1試料的制備

取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)。

——取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。

——取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。

——取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。

6.2樣品的保存

－20℃以下保存。

7測(cè)定步驟測(cè)定步驟

7.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密量取10μg/mL的常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用甲醇溶解并稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?0、100、300、

500和1000μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0mL，分別加至經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試料洗脫液

中，于38℃水浴下氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相1.0mL溶解殘余物，供高效液相色譜法測(cè)定。以測(cè)得峰面積

為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

7.1提取

稱(chēng)取試料（4+0.04）g，于100mL離心管中，加胰蛋白酶50mg，加水2mL（肝臟組織）或水10

mL（肌肉組織），渦動(dòng)1min，用10％碳酸鈉溶液調(diào)pH至8.0，于40℃水浴下酶解3h。取出，放至

室溫，加10％碳酸鈉溶液2mL，渦動(dòng)1min，再加乙酸乙酯20mL，渦動(dòng)10s，在冰水浴中靜置3min，

立即2000r/min離心2min，將上清液轉(zhuǎn)入100mL分液漏斗中。下層液用乙酸乙酯20mL重復(fù)提取一

次，合并兩次上清液于同一分液漏斗中，加0.125mol/L乙酸銨溶液10mL，振搖1min，靜置2min，

收集下層水相。再加0.125mol/L乙酸銨溶液10mL，重復(fù)萃取一次，合并兩次水相，轉(zhuǎn)至雞心瓶中，

于38℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除盡殘余的乙酸乙酯，備用。

7.2凈化

HLB柱依次用甲醇3mL、水3mL和0.125mol/L乙酸銨3mL活化，取備用液過(guò)柱，控制流速1

４

mL/min，用甲苯2mL洗滌，擠干，用甲醇3mL洗脫，收集洗脫液，于38℃氮?dú)獯蹈桑昧鲃?dòng)相1.0

mL溶解殘余物，混勻，濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜法測(cè)定。

7.4測(cè)定

7.4.1色譜條件色譜條件

色譜柱：C18（150mm×3.9mm，粒徑4μm），或相當(dāng)者；

流動(dòng)相：乙腈-0.25mol/L乙酸銨緩沖液-水

流速：1.0mL/min；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：243nm；

進(jìn)樣體積：25μL。

7.4.2測(cè)定法測(cè)定法

取試樣溶液和相應(yīng)的對(duì)照溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算。對(duì)照溶液及試樣

溶液中常山酮響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的線(xiàn)性范圍之內(nèi)。在上述色譜條件下，對(duì)照溶液和試樣溶液的高效

液相色譜圖分別見(jiàn)附錄A。

7.5空白試驗(yàn)

除不加試料外，采用完全相同的步驟進(jìn)行平行操作。

8結(jié)果計(jì)算和表述結(jié)果計(jì)算和表述

試料中常山酮的殘留量（μg/kg）：按下式計(jì)算

X=

C×V

m

式中：X—供試試料中常山酮的殘留量，μg/kg；

C—試樣溶液中常山酮濃度，μg/mL；

V—溶解殘留物所用流動(dòng)相體積，mL；

m––供試試料質(zhì)量，g。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白試料值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

５

9檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

9.1靈敏度

本方法檢測(cè)限為25μg/kg；定量限為50μg/kg。

9.2準(zhǔn)確度

本方法在50~500μg/kg添加濃度水平上回收率為80％～110％。

9.3精密度

本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。