1、1,Monk Transcribing Manuscript,- DNA轉錄合成RNA - RNA加工 - RNA復制,LW-1,以DNA分子的一條鏈為模板、在DNA指導的RNA聚合酶催化下進行的RNA合成,以RNA為模板進行的RNA合成(主要為某些病毒基因組的復制),RNA生物合成及加工,DNA轉錄,RNA復制,2,同為酶促核苷酸聚合反應，DNA轉錄和復制的基本化學性質相似： - 均以DNA為模板 - 聚合過程都是在(脫氧)核苷酸之間生成磷酸二酯鍵 并連接成多聚(脫氧)核苷酸新鏈 - 合成方向均為53 - 都遵從堿基配對規(guī)律 但相似之中又有區(qū)別： 復 制 轉 錄 模板 兩股鏈(全長) 模板鏈

2、(不對稱/選擇性) 原料dNTP NTP 酶 DNA-pol (需要引物) RNA-pol (無需引物) 產物 子代雙鏈DNA mRNA, tRNA, rRNA, 配對 A-T, G-C A-U, T-A, G-C,LW-2,1. DNA轉錄合成RNA,3,26-2,26-3,- 結構基因分布在兩股鏈的不同區(qū)段， 而且只有其模板鏈才能被轉錄 - 通常都假定控制轉錄的調節(jié)序列是位于編碼鏈上的, 轉錄模板不對稱 (不對稱轉錄) - 與需要保留物種全部遺傳信息的DNA復制不同，轉錄 是有選擇性的：要根據(jù)細胞類型及其在不同發(fā)育階段 的需求和生存條件的變化而選擇性進行,模板鏈(Watson),編碼鏈(C

3、rick),轉錄產物,4,26-4 (3rd),H21.2,- 亞基有多種類型，分別 辨識不同的調節(jié)序列，最 常見的是70 - RNA合成的活性部位由 和構成 - 細胞內 : : : = 4,000 : 2,000 : 2,000 : 600 - 缺乏獨立的35校對外切 活性位點，但有些在錯配時 可直接逆轉聚合活性校正之,全酶為五亞基的六聚體2 - 活細胞的轉錄起始需要全酶， 為辨認轉錄起始點所必需 - 轉錄延長階段/試管內合成僅 需要核心酶2, 轉錄酶/RNA聚合酶,core enzyme (Mr 390k),holoenzyme,(cf. p456：亞基功能),原核類(E. coli)的R

4、NA-pol (催化多種RNA合成),自學,5,Zh12-4,RNA-pol、各亞基電泳分離,轉錄產物鵝膏蕈堿 RNA-pol 45S-rRNA 耐受 RNA-pol hnRNA 極敏感 RNA-pol 5S-rRNA 中度敏感 tRNA snRNA,- RNA-pol最為活躍：mRNA是 DNA和蛋白質之間的銜接點， 壽命最短且最不穩(wěn)定，需要經常 重新合成 - 真核類RNA-pol均無原核類亞 基的對應物，需借助各種轉錄 因子才能辨識及結合于啟動子,真核類RNA-pol主要有三種，均由多個亞基所組成,自學,6,操縱子轉錄功能單位(順式作用元件) = N 個結構基因上游調控系列(包括啟動子)

5、啟動子RNA-pol全酶結合模板處(由亞基辨識) 可采用RNA-pol保護法(DNA足跡法)定位 啟動子共有序列 35序列：TTGACA識別區(qū) 10序列：TATAAT= Pribnow box 啟動轉錄的DNA局部解鏈處 由平衡常數(shù)測定結果推論：35序列為亞基對轉錄起始 的辨認位點，與之松散結合后全酶即向下游移動， 到達Pribnow box即跨入轉錄起始點，形成相對 穩(wěn)定的RNA-pol+DNA復合物并開始轉錄,LW-3,operon,promoter, 模板與酶的辨認結合,7,Zh12-5, 啟動子中的-35和-10共有序列,識別區(qū),啟動轉錄的DNA解鏈處,真核類也有類似的起始區(qū)上游序列，

6、多為5-TATA (Hogness box)，但不如原核類的-35和-10序列典型,1,不對稱的啟動子 結構決定轉錄方向,突變會影響RNA-pol與啟動子結合的速度，但不影響附近的DNA解鏈,突變的影響與識別區(qū)的相反,自學,8,26-1a,- DNA模板在轉錄過程中 始終有17 bp被暫時 解開并形成轉錄泡 - 轉錄得到的RNA-DNA 雜合鏈始終保持8 bp - RNA-pol在延長階段大約 覆蓋35 bp的DNA區(qū)段,- 原核類在起始階段需要全酶參與 - 延長是核心酶催化下的NTP聚合反應 - 轉錄終止一般具有兩種方式,轉錄泡, 轉錄過程 (E. coli) 分為起始、延長和終止三階段，全

7、程都需要RNA-pol催化 (真核類的轉錄與之基本相似 但更為復雜),NTP channel,9,26-1b/c,- 轉錄泡前、后分別形成正、負超螺旋 - 需要相應的拓撲酶參與解決因此而產生 的拓撲性變化, DNA在轉錄過程中的超螺旋變化,重旋,解旋, subunit,自學,10,26-6,a. 結合 - RNA-pol先與啟動子相互作用以 形成封閉的復合體 - 隨后在-10序列和+23位點之間 的1215 bp區(qū)段解開雙螺旋并 形成開放的復合體 b. 啟動 (轉錄的引發(fā)啟動子的解離) - 一旦RNA最初的89 nt片段發(fā)生 聚合，亞基便隨即釋出 - 隨后RNA-pol核心酶也離開啟動子 并開

8、始延長RNA鏈,(其雙鏈尚未解開), 轉錄起始可分為結合 和啟動兩階段,11,LW-4,- 起始復合物：RNA-pol (2)DNApppG(pN)89-OH3 - RNA-pol可催化兩個與模板配對的NTP生成磷酸二酯鍵直接 連接而無需引物 - 起始生成的RNA(5端) 1st個核苷酸總是GTP/ATP，與2nd個 NTP聚合后仍保留其5端的ppp，即產物為5pppG/ApN-OH3 (hnRNA加工時即在該獨特的四磷酸二核苷酸結構上加帽) - 的脫落導致核心酶構象變化，以適應與模板不同區(qū)段結合的需要 - 轉錄復合物：RNA-pol (2)DNA(pN)n-OH3 - 核酸中堿基配對的穩(wěn)定性

9、為GC AT AU，因而已轉錄完畢 的局部DNA雙鏈必然會趨于重旋復合，而轉錄產物RNA的5端則 逐漸伸出轉錄泡外, 轉錄起始, 轉錄延長,12,LW-5,依據(jù)是否需要有特殊蛋白因子的參與可分為兩類： 內在性終止RNA-pol對DNA模板的終止信號(內在性終止子) 直接應答而停止轉錄 - 特殊回文區(qū)段富含GC序列，具有鏈內堿基互補配對能力， 可使轉錄的RNA形成1520 bp的莖-環(huán)/發(fā)夾結構 - 回文區(qū)段后的富含AT序列使轉錄的RNA 3端生成poly U(68) 依賴因子性終止停止轉錄需要有因子參與 - 因子為六聚體蛋白，具有RNA-DNA解螺旋酶活性 - 因子能結合RNA并通過水解NTP

10、在RNA鏈上前移 - 與RNA-pol結合后將導致因子和酶都發(fā)生相應的構象 變化，進而在其解螺旋酶活性作用下使RNA-DNA雜化 雙鏈拆離并釋出轉錄產物, 轉錄終止,遇到某些特殊區(qū)段時，RNA-pol會在DNA模板上停頓而不再前移并導致轉錄產物RNA脫落,13,G31.7,26-7b,poly U(68),轉錄產物的3端可通過鏈內堿基對形成發(fā)夾結構而改變RNA-pol的構象，進而影響酶和模板的結合方式，使酶不再向下游移動而停止轉錄 - RNA鏈在終止區(qū)要形成自身雙鏈，DNA 則傾向于恢復雙鏈結構，因而轉錄產物中 形成的雜化鏈要比應有的長度更短，雜化 鏈更不穩(wěn)定而導致轉錄復合物趨于解體 - rU

11、dA配對最不穩(wěn)定，故3端的poly U可 促進RNA鏈從模板上脫落, 轉錄內在性終止 (E. coli的trp基因),14,G31.8, 依賴因子性終止,終止子,因子識別并與mRNA結合,利用水解NTP提供的能量前移,RNA-pol遇到由終止子轉錄的RNA區(qū)段時暫停/減緩轉錄,因子趕上并與之結合，導致自身和酶都發(fā)生相應的構象變化,解螺旋酶活性使雜化雙鏈拆離而釋出轉錄產物,15,D8-28, E. coli轉錄過程小結,與核心酶結合并辨認模板轉錄起始位點,轉錄開始,RNA鏈延長,與RNA 聚合酶結合,RNA、 及酶的釋放,釋放及循環(huán),自學,16,26-10,平面環(huán)的嵌入使DNA雙鏈變形 - 雙螺

12、旋解旋23 - 相鄰堿基對分開7,放線菌素D和吖啶的平面環(huán)均可通過嵌入DNA雙螺旋的相鄰GC堿基對之間而阻斷轉錄的進行, 轉錄抑制劑,兩個五環(huán)肽能與DNA雙螺旋的淺溝結合而干擾轉錄的啟動,自學,17,G31.4,利福霉素B和利福平均能專一性抑制原核生物的RNA-pol,利福霉素B - 專一性結合RNA-pol 的亞基、阻斷啟動 部位與1st NTP的結合 - 合成一旦啟動就不再 能影響轉錄的延長 利福平 - 允許1st個磷酸二酯鍵 的形成，但阻斷 RNA-pol沿DNA模板 前移,自學,18,LW-6,- 轉錄后生成的大多是RNA前體(初級轉錄產物)，需要 在酶的作用下經過一定的加工后才能成為

13、有活性的 成熟RNA - 真核類的轉錄后加工主要發(fā)生在細胞核內，各種RNA 的加工過程均具有相應的特點 剪切和剪接前者僅為剪去部分序列，后者在剪切后 還需要將相應的片段再連接起來 末端添加核苷酸eg. 5-端加帽和3-端加尾 化學修飾主要發(fā)生在堿基上，eg. 甲基化、還原和 脫氨等反應生成tRNA中的某些稀有堿基,2. RNA加工,19,26-11,- 加工方式包括剪切、聚腺苷酸化和剪接(去除內含子并連接外顯子) - 5-帽多在前體轉錄完成之前加上，3-poly A尾則在加工過程中形成,轉錄及5-加帽(m7G),形成初級轉錄產物 (= hnRNA),剪切、聚腺苷酸化和剪接等加工處理,外顯子 D

14、NA中的編碼序列，可轉錄為RNA并進而翻譯成蛋白質 內含子 DNA中的間插序列，轉錄成RNA后即被切除而不翻譯,poly A(80250), 真核類的mRNA前體及其加工成熟,20,26-12 (3rd),先將該基因的DNA片段完全失活，再加入相應的成熟mRNA進行復活處理，在RNA-DNA雜化鏈上呈環(huán)狀突起(無法與相應的RNA堿基配對)的DNA區(qū)段即為內含子,whole gene for ovalbumin, 雜化法檢測基因內含子 (雞卵清蛋白),21,26-13,- 游離鳥苷(酸)的 3-OH對外顯子和 內含子之間的磷酸 二酯鍵親核攻擊 - 新形成的磷酸二酯 鍵維持反應的能量 平衡(非水解

15、反應),由不同的內含子基本類型可派生出多種剪接方式 (cf. p606),自我剪接類型的1st步轉酯反應,類型和均為自我剪接，分別借助于外源性的鳥苷(酸)和內源性的腺苷酸進行轉酯反應，催化機制類似于拓撲異構酶, 剪接去除內含子,22,26-14,- 1st個親核體可以是鳥苷、 GMP、GDP或GTP - 鳥苷(酸)3-OH親核攻擊5- 端剪接點，釋出上游外顯子 - 上游外顯子的新游離3-OH 轉而親核攻擊3-端剪接點 并以磷酸二酯鍵與下游外 顯子的5-端連接 - 鳥苷(酸)僅為外源性輔助因 子，并未摻入外顯子中 - 切掉的內含子可以再經由 類似的轉酯反應而環(huán)化或 最終被降解,5-端 剪接點,3

16、-端 剪接點,攻擊自身5-端15 nt處而環(huán)化, 類型自我剪接 (真核類細胞器基因),23,26-15,- 親核體為內含子自身的某個 特定腺苷酸，由其2-OH對 5-端剪接點進行攻擊，形成 不常見的2,5-磷酸二酯鍵并 構成套索結構，其余反應與 類型相似 - Thomas Cesh等(1982)由此 意識到，某些RNA也能具有 一定的酶活性，并進而提出 在生化及分子生物學中具有 里程碑意義的核酶概念,套索分支點處的腺苷酸 具有3個磷酸二酯鍵, 類型自我剪接 (某些真菌線粒體和 植物葉綠體基因),24,hnRNA剪接中U1和U2的作用,26-16a,為真核類mRNA剪接加工的主要方式， 反應機制

17、與類型自我剪接相似： - 內含子先形成套索結構 - 再經由轉酯反應將兩端外顯子連接起來 - 反應需要有snRNP與內含子結合形成 的剪接體參與,核內小核糖核蛋白 由snRNA (核內小RNA)和相關蛋白組成，各種真核類的snRNP組分均高度保守, hnRNA剪接需要借助于snRNP剪接體,U1的5-端具有與內含子5-端互補的序列，兩者的配對有助于確定內含子5-端剪接點,U2的互補序列可覆蓋內含子中靠近3-端剪接點的特定腺苷酸殘基并使之激活，后者在剪接時成為親核攻擊體 ( 辨識及結合3-端剪接點),假尿嘧啶,親核攻擊,自學,25,- U1和U2 snRNPs與hnRNA的5- 及3-端剪接點結合

18、(ATP供能) - U4/U6復合物和U5再與之結合 形成非活性剪接體(ATP供能) - 經內部重排轉化為活性剪接體： U1和U4脫離，U6則同時與5- 端剪接點和U2互補結合，使 特定腺苷酸殘基的親核攻擊體 靠近剪接部位(ATP供能) - 通過類似于類型的方式完成 剪接反應,26-16b, 剪接體的組裝及剪接加工 (cf. p482),自學,26,26-17 (3rd),- 核酸內切酶斷裂內含子的兩端將其 移除，切口的5-端均為-OH，而 3-端均為2,3-環(huán)磷酸基 - 上游外顯子3-端的2,3-環(huán)磷酸基被 環(huán)核苷酸磷酸二酯酶打開，形成2- 磷酸基和3-OH (親核攻擊體) - 下游外顯子5

19、-OH經由激酶和連接酶 連續(xù)反應活化(消耗3 ATP當量) - 上游外顯子的3-OH對下游外顯子的 5-端攻擊并取代其AMP，將兩個外 顯子以3,5-磷酸二酯鍵連接起來， 隨后2-磷酸基被磷酸酯酶水解移除,AMP, 酵母和植物的tRNA前體剪接 需要ATP和核酸內切酶等參與 (反應機制類似于DNA連接酶),自學,27,26-12a,- 幾乎所有真核類的mRNA在其5-端 都有一個以稀有的5,5-三磷酸連接 的7-甲基鳥苷 - 1st (起始鳥苷)和2nd個核苷酸的2-OH 有時也被甲基化(酵母缺乏) - 由RNA-pol/轉錄的其他類型RNA (非hnRNA)都沒有這類5-帽結構,通常為G/A

20、,四磷酸二核苷酸, 首、尾修飾/末端添加,- 通常在hnRNA階段已經存在有修飾 好的首、尾結構，先于mRNA中段 的剪接加工 - 首、尾修飾功能涉及到翻譯的識別、 mRNA的穩(wěn)定以及保護其模板活性, 5-端形成7-甲基鳥苷三磷酸帽,(m7G),28,26-12b,- 磷酸水解酶除去起始鳥苷的P - 鳥苷酰轉移酶將GTP的GMP- 基轉移給起始鳥苷的二磷酸基 生成三磷酸雙鳥苷5GpppG- - 鳥嘌呤-7-甲基轉移酶使新添加 的鳥苷N7位甲基化(帽0) - 2-O-甲基轉移酶使原起始鳥苷 的2-OH甲基化(帽1) - 甲基供體均為S-腺苷Met, 5-帽的形成,轉移GMP后再進行兩步連續(xù)的甲基

21、化反應,自學,29,26-17,- hnRNA 3-端含有高度保守的腺苷酸 化信號序列AAUAAA - 酶復合體辨識并與信號序列結合，該 復合體包括內切酶、聚腺苷酸聚合酶 和幾種多亞基蛋白因子，功能涉及到 辨識信號序列、引發(fā)斷裂以及poly A 長度的調節(jié)等 - 內切酶在信號序列下游1030 nt部位 切斷 - 聚腺苷酸聚合酶在切點處添加80250 A (反應無需模板，但需要具有游離 3-OH的RNA片段為引物) - poly A對翻譯模板的穩(wěn)定非常重要： mRNA的降解通常起始于poly A的 縮短(35降解)，而其去腺苷酸化 達到一定程度時還能引發(fā)5-端的脫帽 反應，進而導致mRNA的53

22、降解, 3-端添加多聚腺苷酸尾,30,26-18, 典型真核類mRNA加工小結 (雞卵清蛋白基因),加工完成后只有 hnRNA前體轉化為成熟的mRNA，后者進入胞液后再開始翻譯,先導序列,31,26-23,酵母tRNATyr的加工,甲基化 eg. A/GmA/mG 還原 eg. U二氫U 核苷內轉位 eg. 尿苷假尿苷 脫氨 eg. 腺苷次黃苷/肌苷, 化學修飾,多見于tRNA的前體加工，被修飾堿基的功能涉及到在翻譯過程中tRNA對密碼的識別,原核生物沒有這類內含子,32,26-24, tRNA的常見修飾堿基,4-硫尿苷,次黃苷/肌苷,1-甲基鳥苷,假尿苷,N6-異戊酰腺苷,胸腺嘧啶核糖核苷,

23、二氫尿苷,自學,33,26-21, 原核類 - 30S前體斷裂前先在 特定核苷酸處甲基化 (多為核糖的2-OH) - 在專一性核酸內切酶 作用下斷裂成rRNA 和tRNA前體 - 經各種專一性核酸酶 作用最終產生16S rRNA，tRNA，23S 和5S rRNA - 有些種類在16S和23S rRNA之間以及前核糖 體RNA的3-端還含有 另外的tRNA片段, rRNA前體加工,由前核糖體RNA加工而得： 原核類30S RNA16StRNA23S5S rRNA 真核類45S RNA18S5.8S28S rRNA,1-RNase；2-RNase P (核酶)；3-RNase E,自學,34,2

24、6-22, 真核類,- 45S前體先在100多個 核苷酸殘基上甲基化 - 經由一系列酶促剪接 反應最終生成18S, 5.8S和28S rRNA，反 應需要有各種核仁小 RNA (snoRNA)參與 - 真核類的5S rRNA大 多是通過RNA-pol 轉錄生成的,自學,35,LW-7, 與RNA病毒有關的基本概念 復制酶RNA指導的RNA聚合酶，具有高度模板特異性，只能 識別特定病毒自身的RNA (+)RNA具有(復制酶)mRNA翻譯模板功能的病毒RNA ()RNA只有其互補鏈才具有mRNA翻譯模板功能的病毒RNA,3. RNA復制,除了在遺傳信息表達(翻譯)和調節(jié)中具有決定作用外，RNA在有

25、些生物種類還是遺傳信息的基本攜帶者，并能通過復制進行傳遞,()雙鏈RNA (&復制酶 ),(+)RNA ()RNA ,mRNA (+)鏈, ()雙鏈DNA ()DNA (+)RNA,()RNA (&復制酶), 病毒RNA復制的四種方式 (cf. 王鏡巖等：p493),eg. corona virus,oncorna virus,復制酶,36,- (+)RNA類，基因組2731 kb - 通過胞吞作用和融合反應 進入宿主細胞并釋出 (+)RNA - 正鏈5-端約20 kb序列翻譯 產生復制酶/病毒RNA聚合酶 - 復制酶以正鏈為模板 合成完整的()RNA - 以負鏈為模板合成新的正鏈 以及一些長度不等的mRNA 嵌套片段(翻譯各種病毒蛋白) - 新合成的正鏈與病毒蛋白在 Golgi體組裝成病毒顆粒并釋出,Golgi體,粗面 內質網,LW-8, SARS冠狀病毒的復制,37,LW-9,小結：RNA生物合成及加工,- 轉錄由DNA指導的RNA聚合酶催化進行；依據(jù)雙鏈 DNA的模板鏈以NTP為原料合成出RNA互補鏈；轉錄 可分為幾個階段：RNA聚合酶與DNA上的啟動子序列 結合、轉錄合成的啟動、延長和終止,-