1、第八章 受體的放射配體結合分析技術,受體 是細胞膜或細胞內的大分子，它的作用是和細胞外的信息分子呈特異性結合，然后將信息轉變?yōu)榧毎?，因此受體的功能是識別和信息轉導。,受體的進一步解釋:受體是細胞膜或細胞內的一些能首先與生物活性分子(藥物,毒素,神經(jīng)遞質,激素和抗原)相互作用的分子,它們具有三個相互關聯(lián)的功能: (1)識別和結合,即通過高親和力的特異過程,識別并結合與其結構上具有一定互補性的分子-配基 (2)轉導信號:受體和配基相互作用產(chǎn)生信號,傳遞到效應器,如酶,離子通道等,使它們的活性或構象發(fā)生與導致生理效應相適應的變化.,(3)產(chǎn)生相應的生物效應:效應的強度與體外實驗所測得的激動劑親和

2、力的大小相應. 當然,如果受體所結合的是秸抗劑,則應表現(xiàn)為生物效應的阻斷作用. 受體鑒定的標準: 飽和性 高親和力 立體選擇性 可逆性 靶組織的專一性 存在競爭性拮抗劑 具有內源性配基 受體配基結合誘發(fā)生理效應,受體的分類: 神經(jīng)遞質受體 激素受體 攝取血漿蛋白或轉運物質的受體 細胞黏附受體 直接參與免役功能的受體 藥物受體 毒素受體病原體受體,受體的放射配體結合分析 是建立在放射性標記配體和受體間的理化結合反應，通過反應給出一定量靶組織或靶細胞中能與配體結合的受體數(shù)，用結合位點數(shù)表示，另外通過多點測量，經(jīng)數(shù)據(jù)處理可給出受體的親和力（常以平衡離解常數(shù)表示），應該指出，受體測定結果應與該受體的結

3、合特性和介導的生物效應作綜合分析，作出正確判斷。,受體與疾病 受體與疾病的關系主要表現(xiàn)在兩個方面： 一方面:受體的變化導致疾病的產(chǎn)生和加重其發(fā)展， 另一方面:在疾病過程中產(chǎn)生了受體的變化。 以受體改變?yōu)槠鹨虻募膊。Q為受體病 多種原因引起的很多疾病中所產(chǎn)生的受體的改變，也成為研究這些疾病的防治的主要方面。 可分為以下幾種。,疾病時受體的變化 （1）受體數(shù)目的變化 有很多疾病出現(xiàn)受體數(shù)目的變化，其中以胰島素受體的變化最為顯著。 例如: 肥胖癥是一種因胰島素數(shù)目減少而發(fā)生的疾病，這種病人單核細胞或脂肪細胞中胰島素受體數(shù)目明顯減少而親和力不變。,（2）受體親和力的變化 包括兩種完全相反的變化。 一種

4、是受體親和力增加 例如:肢端肥大癥和胰腺瘤時，胰島素受體親和力增加。 甲狀腺激素使兒茶酚胺受體的親和力增加等；,另一種是受體親和力降低， 例如哮喘病人外周血液淋巴細胞受體，在最大結合容量減少的同時，伴有親和力的降低。 某些類型的受體的自身抗體亦可使相應受體的親和力減弱。,（3）受體特異性的變化 受體的特征之一是具有高度特異性，即特定的受體只與相應的藥物或激素等配基相互作用。 但是，有時這種特異性并不嚴格。 一種受體除了對本身的配基具有很高的親和力外，還能以低親和力與另一種或多種激素或藥物等結合，即表現(xiàn)為兼并性。,在正常情況下，受體可能完全不與這些配基起反應，但當后者過量時，兩者就會相互作用，并

5、產(chǎn)生一定的效應。 這種情況稱之為受體特異性的外溢。 主要發(fā)生于某些病理狀態(tài)。 （4）受體的自身抗體 多數(shù)受體的化學本質是蛋白質，它們都有抗原性。大量實驗表明，在受體蛋白質上存在特異的抗原決定簇。,但是，由于免疫自穩(wěn)作用，正常機體并不產(chǎn)生受體的自身抗體。 然而，由于遺傳缺陷的內因存在，或在感染等外因作用下，機體不能免疫麻痹自身抗原，破壞了原有的免疫動態(tài)平衡，發(fā)生了對受體的病理免疫反應，因而表現(xiàn)為自身免疫病。 受體的自身抗體有下列作用： 加速受體降解、降低受體濃度，使之不足以介導正常的生物效應；,阻斷受體與激素結合，造成一種抗激素狀態(tài)； 模仿正常情況下被激活的受體的作用。 具有前兩種作用之一的自身

6、抗體，統(tǒng)稱為封閉性抗體；如受體和煙堿型乙酰膽堿受體的自身抗體，它們能與相應的抗原（即受體）結合，形成免疫復合物，從而導致受體數(shù)目減少，或親和力下降，或兩者均有之，干擾了受體與激動劑結合，最終導致靶細胞的功能低下或完全喪失。,對于能模仿激動劑作用的抗體，則稱之為刺激性抗體；困為它們能激活受體，使靶細胞功能異?？哼M；胰島素受體的抗體即屬于這一類。受體的自身抗體通常為IgG，遇見屬于其他Ig類型的抗體。 例如： 重癥肌無力的病因是由于產(chǎn)生了煙堿型乙酰堿受體的自身抗體。 促甲狀腺激素受體自身抗體則患彌漫性毒性甲狀腺腫；,胃泌素受體自身抗體形成伴有惡性貧血； 受體的激動性自身抗體導致哮喘和過敏性鼻炎等。

7、 （5）受體-效應器偶聯(lián)機理異常 受體-效應器偶聯(lián)機異常亦稱之為“受體后缺陷”。 常見于胰島素和甲狀旁腺激素受體的變化；后者為例，主要是其受體的信號轉導系統(tǒng)的改變：與其相偶聯(lián)的Gs的數(shù)量減少，而Gi則是正常的。這種變化的結果是，與腺苷酸環(huán)化酶解偶聯(lián)，cAMp的生成量減少。,2、受體理倫在疾病研究中的應用 （1）探討疾病的發(fā)病機理 以高血壓發(fā)病的受體失敏為例，在血管平滑肌的細胞膜上存在著多種物質的受體。 其中受體、前列腺素、腺苷和5-羥色胺等的受體被激活可導致血管擴張；這些受體都是通過激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），增加cAMP的含量，進而產(chǎn)生效應。 而受體是介導血管收縮效應的受體。如果交感神經(jīng)功能亢

8、進，所釋放的遞質持續(xù)增多，它們持久地作用于受體，可導致受體AC系統(tǒng)的活性降低。,從分子水平觀察，此時AC的調節(jié)亞基與催化亞基解聯(lián)，使后者難以正常催化由ATP轉變?yōu)閏AMP的反應。由于這一系統(tǒng)對其他介導血管擴張作用的受體（PG，腺苷和5-HT）是通用的，它的功能障礙導致這些擴張血管物質的作用減弱，從而表現(xiàn)為血管擴張反應遲鈍。與此同時，過量的遞質會與受體結合，使之過度興奮，導致血管收縮。這兩種效應的最終結合即表現(xiàn)為高血壓。受體阻斷劑治療高血壓有效，從實踐上證明上述解釋是正確的。,（2）從受體變化尋找疾病的病因 主要包括免疫學異常和遺傳缺陷的疾病。很多自身免疫疾病是由于受體的自身抗體引起的，如乙酰膽

9、堿受體的抗體所致的重癥肌無力，促甲狀腺受體的抗體所致的彌漫性毒性甲狀腺腫等。 根據(jù)這些自身抗體對受體的作用，可將其分為封閉性和刺激性兩大類。,封閉性抗體能通過與受體結合，競爭性地抵制配基與受體相互作用；此時盡管激動劑的水平是正常的，也不能引起應有的生理效應，因為受體已被自身抗體占領； N受體的自身抗體屬于這一類。 刺激性抗體能模仿受體-激動劑的某些效應，使受體處于異常的活躍狀態(tài)，表現(xiàn)為某些功能的亢進； 促甲狀腺素和胰島素受體屬于這一類。,（3）根據(jù)受體測定結果選擇治療方案 例如： 以乳癌的治療為例，除手術治療外，還可以采用內分泌療法和化學治療。但是，病人適合于什么治療，取決于癌細胞中是否存在雌

10、激素和孕酮受體（ER和PgR）。以同時存在雌、孕激素兩種受體時內分泌療法效果最好，而當兩種受體均為陰性時化學療法才能有效。實驗證明，受體陰性的癌細胞的增殖速率比受體陽性者快得多；因此，它們必然攝取較多的具有細胞毒性的化學治療物質，故對化學療法敏感。,在乳癌的非手術治療中，ER和PgR測定已被列為決定治療方案前的常規(guī)檢查。 糖皮質細胞中GR濃度很低，則上述藥物的治療效果往往很差。這可能是因為在急性白血病時，缺乏正常量和正常功能的GR。,（4）受體變化作為疾病預后的指標 ER陽性的乳癌病人的存活時間和術后的緩解期，都要比受體陰性者長一些。在急性淋巴細胞性白血病患兒髓中GR的檢查結果表明，凡是GR水

11、平低下者，即使經(jīng)過治療有所緩解，也往往迅速復發(fā)。 （5）受體研究可直接為疾病尋求防治措施 霍亂弧菌所產(chǎn)生的外毒素（CT），是通過細胞膜上單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯（GM1）作為受體而發(fā)揮作用的。體外實驗表明GM1能阻斷CT與膜上的GM1結合；抵制CT的,生物效應；從溶液中將CT沉淀下來。根據(jù)GM1的這些特征，已將它制成適當?shù)闹苿?，在治療霍亂中取得了較好的效果。 放射配基結合法 基本原理： 是利用受體和配基結合的專一性以及放射性同位素測量的高靈敏度的特點，用放射性核素標記配基（*H），在一定條件下，使其與受體（R）結合，形成受體一配基復合物（R*H），測量R*H的放射性活度。 可用下式表示： R + *

12、H = R * H,放射性標記配基結合實驗的目的是觀察和確定放射性標記配基和受體間的物理化學相互作用。,式中，*H不僅和受體呈專一性結合，還和非受體組織蛋白（P）呈非專一性結合，形成P*H。 雖然，非受體蛋白和*H的親和力比受體小，但其濃度要比受體蛋白大得多，因此P*H值可以很大，干擾對R*H的測定。 如何減少P*H值是放射配基結合法能否成功的關鍵。 解決的辦法是：,1、利用*H和R的親和力高，同P的親和力低這一特點，盡可能用低濃度的*H。但（*H）濃度低，（R*H）值也低，為了達到儀器可以測量的程度，應當盡可能用高放射比度的標記配基。 2、利用*H和R的專一性結合的特點，應當盡可用高純度的標

13、記配基。 3、利用受體蛋白容量少，可飽和性，而非受體蛋白高容量，非飽和性的特點，加濃度為*H100500倍的非標記（H），以校正非特異結合，可用下式說明,P+R+ *H=R * H+P * H （A） P+R+ *H+H=RH+P * H+P* H （A） （H * H） （A）dpm-(B)dpm相當于(R * H+P * H)-P * H 根據(jù)上述原理，放射配基結合法必須具備以下條件： （1）標記配基 為了保證標記配基的比放射性、放射性純度、穩(wěn)定性以及是否適用于專一結合，應注意以下幾方面：, 配基選擇。 組織內受體量很少，在進行分析時必須選擇同受體有高親和力的激動劑或拮抗劑，在較低的配基濃

14、度即能保證得到專一性的最大結合率。 專一拮抗劑優(yōu)于激動劑，一般要求標記配基的濃度最好能小于受體配基絡合物的解離常數(shù)。,例如：最常用的是3H標記物，其比放射性應大于3.71010Bq(10Ci)/mmol。 優(yōu)點: 比較穩(wěn)定，生物學效應不致改變，半衰期較長，也比較容易合成高比放射性標記化合物； 缺點: 須由專門實驗室合成。 125I標記物: 優(yōu)點: 是可獲得高比放射性的配基，如高達到3.71010Bq(1000Ci)/mmol以,上，并可在一般同位素實驗室內合成； 缺點: 配基必須含有芳香族羥基，如酪氨酸殘基，在配基分子中，參入一個碘原子一般不會影響它的生物活性，但參入二個以上的碘原子時，會降低

15、配基的生物活性。此外，在標碘過程中，也可引起配基分子的改變。碘化的配基與原來的配基不完全相同，且不易純化。另外，125I標記物的半衰期只有二個月。,檢測標記配基的放射性純度。 常規(guī)結合實驗只有大約10%的標記配基與組織受體結合，因此放化純度應在90%以上。最常用的純度檢查是薄層層析，有時也可用核磁共振檢查配基分子結構的細微改變。經(jīng)過純化后的樣品，在使用前還應該作放射性濃度測定。,樣品的貯存。樣品應放在密封避光瓶中，必要時加入抗氧化劑低溫保存。 監(jiān)測標記配基是否變質。 在結合實驗中，最好先檢查標記配基是否發(fā)生改變。其辦法是將配基與相應的膜受體制劑溫育，在反應終止時，抽提結合在組織受體上的放射性物

16、質，用TLC法分析純度，其Rf值在保存期間應該保持一致。,（2）受體組織 建立受體結合實驗時， 首先，應該充分考慮選用合適的生物組織，該組織應含有對特定配基有生物學反應的受體。 在一定條件下，受體的結合量與受體組織濃度呈線性關系。就多數(shù)配基來說，專一結合與受體的濃度呈直線關系。隨著受體組織濃度的繼續(xù)增加，專一結合出現(xiàn)下降趨勢，表明溫育時，標記配基有被組織分解的可能性，或者是組織內存在著內源性配基。,這種內源性配基對標記配基，起著干擾作用。就很多受體來說，另一個可能性是標記配基的親和力的下降等于或超過結合部位數(shù)目的增加，這時組織量結合效應曲線可能向下曲折。為了得到更精確并可重復的結合數(shù)據(jù)，正式實

17、驗應該選用線性范圍內的組織濃度。,其次，還應該確定專一結合是否限于已知含有這些受體的組織或器官。 例如，所研究的受體，已知只存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，則專一結合就不應該在其他器官，如肺、腎、心、腸等內出現(xiàn)。,受體制劑的制備方法很重要。 多數(shù)神經(jīng)遞質的受體結合實驗，采用洗過的腦組織勻漿。 一般先用勻漿器或超聲波粉碎器，以50100倍容積的的非等滲緩沖液或蒸餾水將腦制成勻漿，然后離心，將沉淀物搗碎，再用上述溶液洗滌一次以上，除去可能存在的內源性物質，以避免對專一受體干擾。,（3）溫育條件 緩沖液。 對神經(jīng)遞質受體結合實驗最適宜的緩沖液是經(jīng)過反復實驗后確定的，包括最適宜的濃度與pH。 常用的無機緩沖液是N

18、a+-K+磷酸溶液，有機緩沖液是Tris溶液。 為了研究離子對受體結合過程的影響，可以采用不含無機離子的緩沖液。如鈉離子可以改變阿片受體的反應性，降低受體與激動劑的親和力，但不改變拮抗劑的作用強度。同樣，硫氰酸鹽和碘鹽，可增加拮抗抑制腦受體結合3H-GABA的強度，但不影響激動劑的活性。,幾乎所有受體結合實驗的最適pH都在78，除總結合外，結合部位的專一性也隨pH而變化，所以，最適pH確定后，最好保持不變。 時間與溫度。受體配基相互作用與酶-底物間的反應相似，所以受體結合數(shù)據(jù)的數(shù)學處理基本上與酶化學研究相同?？梢曰炯俣?，即結合反應為“穩(wěn)定態(tài)”，因此，結合實驗必須在平衡條件下進行。早期結合實驗

19、往往溫育不同時間，然后終止反應，從而觀察到一個動態(tài)過程。,在有些情況下平衡幾乎立刻達到，而有些受體結合實驗竟需要60分鐘或更長時間才能達到平衡。在受體結合實驗中，達到平衡是指專一結合達到最高值所需的時間，這一時間為受華表結合反應的反應速度常數(shù)和解離速度常數(shù)的函數(shù)。在平衡時，這兩種速度常數(shù)相等。由此可見，任何影響受體對配基親和力的因素和處理都能影響達到平衡的時間。遇到這種情況，應該在進行動力學分析前，先確定足以達到平衡所需的溫育時間。,既然受體與配基的結合速度和解離速度取決于溫度，這就不難想象，配基結合的量和達到平衡時所需要的時間將受溫度的影響。當最適溫度確定后，就不宜隨便更改。多數(shù)結合實驗是在

20、4和37進行。為了得到精確度、重復性好的數(shù)據(jù)，應該在同一溫度或低于溫育時（常常為4）的溫度終止結合反應。因為，如果結合反應在4，終止結合卻在室溫，則絡合物的結合和解離的速度會隨著溫度不同而有所改變。這種操作條件將得到很不可靠和可變的動力學數(shù)據(jù)。,（4）結合和游離配基的分離法 受體結合反應達到平衡時必須將反應體系中結合和游離的配基分開，也就是終止結合反應。分離技術要要考慮給定溫度，配基從受體解離的速度。已知，受體與配基多以非共價鍵的形式結合，所形成的受體配基復合體解離甚為迅速，這就要求分離應在盡量短的時間內完成。若以已結合配基解離一半的分離時間為1，則解離受體配基復合體的10%，需要時僅為0.1

21、5t1 / 2，而10%的解離已是最大的容許量了。 如何來決定分離時間呢？這決定于平衡解離常數(shù)KD值，大多數(shù)受體與配基相互作用順反應的結合速率常數(shù)不大于10-6mol/(Ls)。,1）過濾法。這是最常用的分離方法。 采用美國Millipore公司生產(chǎn)的1225型過濾器，或者國產(chǎn)的多頭細胞收集器，可同時抽濾12個樣品。使用這種方法時，要注意選擇合適的濾膜，細胞應選擇孔徑為1m的濾膜，若為組織或細胞膜制劑，可選用小于0.2m。一般用What-mat GF/F，也可用國產(chǎn)的海光49型玻璃纖維濾紙。不同的受體可用不同的濾紙，如表皮生長因子用醋酸纖維濾膜，植物凝集素用尼龍濾膜等。,過濾過程一般為1020

22、s。如果受體絡合物的解離速度太快，就易丟失結合的配基。一般，淋洗操作應在低溫約04進行，結合試驗在437進行均可。經(jīng)過充分淋洗，過濾法比離心法可得到更大的專一結合與非專一結合的比值。當絡合物解離常數(shù)在10-910-11mol/(Ls)范圍，本法是很有效的。通常用510ml不含配基的冷緩沖液淋洗濾約23次，最后經(jīng)70 烘干，置于閃爍液中計數(shù)。,過濾法最突出的缺點 是由于濾膜吸附了游離的標記配基而增加了非特異結合。可在緩沖液中加入適量的牛血清白蛋白或明膠以減少吸附。 2）離心法。 多數(shù)結合實驗可用離心法終止。經(jīng)溫育后，將樣品在5000g離心10min。離心時，樣品始終同配基處于平衡狀態(tài)。這樣，結合

23、受體不致喪失配基。離心后，將上清液傾去，用冰冷的緩沖液或水淋洗沉淀物。淋洗操作要快，只需淋洗沉淀物的表面，以免結合配基的喪失。,淋洗要重復一、二次，然后用適當?shù)闹軇⒊恋砦锶芙猓詈髮⒒旌弦汉喜?，加入閃爍液，在液閃儀上計數(shù)。 其缺點是由于膜沉淀物在離心后未經(jīng)充分淋洗，而可能混入非專一結合的放射性，3H計數(shù)往往比過濾法高。同樣，也可能有相當數(shù)量的放射性附著在離心管壁上，故管壁也要徹底淋洗。此外，由于沉淀物致密，游離的配基也不易徹底洗。,3）平衡透析法。 將標記配基受體組織用半透膜隔開，當標記配基自由地透過膜到達平衡時，游離標記配基濃度在膜兩側相等，含受體制劑一邊的標記配基總濃度為游離標記配體與

24、結合配基之和。 因此，結合配基的濃度為膜兩側標記配基濃度之差，所以只有當這個差值有意義時，平衡透析才可靠。 當受體濃度在受體配基絡合物的解離常數(shù)范圍就可得到較好的結合數(shù)據(jù)。若當受體濃度遠遠高于絡合物的解離常數(shù)，其中大部分加入的配基被受體結合，而游離配基濃度很低。,或當受體濃度遠遠低于絡合物的解離常數(shù)范圍時，在含受體制劑的膜的兩側，只有小部分標記配基處于結合狀態(tài)，而大部分為解離狀態(tài)，因此，測得的結合配基的量只取決于膜兩側很小的配基濃度差，所以，這兩種實驗都是不可靠的。正常情況下，經(jīng)過平衡后取出一部分受體組織與緩沖液，檢測其放射性。,有受體組織一邊的放射性與另一側的差代表專一性結合。由于親和力較低

25、，在膜一邊須加入大量受體制劑才能得到明顯的結合。這樣，即使用較高受體組織濃度，平衡透析法還有一個致命的缺點，即受體側與緩沖液一側放射性配基量差別很小，以致難以精確計算專一受體結合量。此外，還必須注意透析膜本身能否結合放射性配基，以免帶入誤差。,4）凝膠過濾。 這是一種既適用于可沉淀受體，又適用于可溶性受體的方法，尤適用于從已增溶的受體制劑中將結合的與游離的配基分開。在實際操作中，大致有兩種方法： A.先將受體制劑與標記配基共同反應，使達到目的平衡，然后將該混合物加入事先用反應液平衡過的凝膠如Sephadex 柱上，通過洗脫，將與受體結合的配基同游離者分開， B.凝膠先以含有低濃度試放射性配基的

26、洗脫液平衡，使達到過飽和；,再將受體制劑回到以這種凝膠填裝的層析柱頂部，并以含有標記配基的洗脫液洗脫，監(jiān)測洗脫液中的放射性，可見與受體結合的放射性配基形成了一個高于基線的“峰”，并隨之以放射性計數(shù)的“谷”；根據(jù)峰與谷的放射性計數(shù)差，即可計算已結合的標記配基量。該法要求受體與配基的結合是高親和力，亦即受體和配基的解離速率相對要緩慢。,5）沉淀法和吸附法。加入硫酸銨、鹽析劑、酸以及聚乙二醇等物質，以降低受體配基復合體溶解度。該法在受體研究中應用比較廣泛。 吸附法是通過吸附游離的配基，而將結合的與未結合的標記配基分開。目前常用字的是葡聚糖覆活性炭（dextran coated charcoal,DC

27、C）法。該法是將惰性支持物活性炭，以葡聚糖之類的多聚碳水化合物包被，使之具有分子篩作用，增加了吸附的選擇性；,小分子的游離配基可穿過葡聚糖“外殼”，被活性炭吸附，而大分子的受體配基復合體則不被除數(shù)吸附。DCC法在胞液受體的測定中得到了廣泛的應用。當然，在具體操作中，對于活性炭的處理，葡聚糖的分子量等均有嚴格要求。 5、降低非特異結合的方法 放射性受體結合分析中配基既可被特異性受體所結合，亦可被細胞的其他組分及濾膜等生物和非犧牲物質非特異地吸附。,非特異結合至少包括三個部分： 真正與組織中非受全結合部位結合的標記配基。 吸附在分離物質包括濾膜、試管上的標記配基。 淋洗不充分而殘存的、或吸附于沉淀

28、中的標記配基。 第一種情況較難以改變。由于通常在制備膜蛋白時采用差速離心法，因此，應增加首次離心力，減少雜蛋白的含量，以降低非特異結合。但這種做法并不總是有效。后兩種情況則相對地容易解決。,除了通常在反應體系中加入濃度遠高于標記配基的非標記的配基外，還可以通過比較不同的洗滌次數(shù)、變更所有緩沖液的pH值等，盡量除去游離配基，也可以向緩沖液中加入抗吸附劑，如清蛋白或膠原蛋白等，以降低分離物質的吸附作用。但是，這種抗吸附物質不宜過量，一般不超過0.1%，最好先確定它本身 并不結合游離的配基。,飽和結合實驗 將濃度遞增的放射性配基，與濃度固定的細胞組織制劑共同反應。 使標記配基濃度遞增的方法有兩種：

29、一是增加加入的標記配基量，但其反應體積和比放射性不變，從而增高反應體系中的放射值； 二是固定反應體系中的標記配基濃度，通過增加非標記配基濃度，稀釋標記配基的比放射性，以便在實際上造成標記配基的濃度遞增。一般多取前者。,從理論上講，受體-配基之間結合的動力學，頗類似于酶-底物的相互作用。 以（R）為未被占領的受體濃度，（L）為游離配基的濃度，（RL）為受體-配基復合體的濃度，依質量作用定律得： （R）+（L）=（RL） 此時，平衡結合常數(shù)既可由締合常數(shù)（KA）決定 即：KA=K1/K2=(RL)/(R)(L)； 亦可由解離常數(shù)（ KD ）決定，即： KD =K2/K1=（R）（L）/（RL）。,

30、如果受體部位是一種類型，不存在異種受體，則配基與受體結合后，只有一個簡單的解離常數(shù)KD ，因此可從上式推導出Scatchard公式。 從這處公式，便可以求得平衡穩(wěn)離常數(shù)KD和最大結合容量Bmax。 B/F=(Bmax-B)/KD 式中，B代表受體特異結合，F(xiàn)代表實際加入的放射配基的終濃度。以B/F對B作圖，所得曲線之斜率為-1/ KD ，從截距可求出Bmax。,例如： 現(xiàn)以大鼠心肌內皮素受體測定為例，介紹受體測定的具體方法5。 將鼠心迅速放入預先冰浴好的生理鹽水中，剪除結締組織，心房肌、心室肌稱重后放入冰冷的勻漿液內含20mmol/L NaHCO3，0.2mol/L苯甲磺酰氟（PMSF），pH

31、7.4中，比例為1：8，剪碎，用高速分散哭勻漿，速度為7000r/min，三次20s，間隔1min以利充分冷卻，將勻漿液以1：20比例稀釋。將稀釋后的勻漿液在低溫高速離心機上以1500g離心15min。取上清液在低溫超速離心機上以40000g離心20min，棄上清液，用50mol/L Tris-HCl液（內含0.2mol/L PMSF，pH7.4）10ml溶解沉淀，再以上速度離心20min，將沉淀用Tris液重懸稀釋后，用牛血清白蛋白做標準以考馬斯亮蘭G-250法測定蛋白量。,3、動力學實驗 總配基濃度保持不變，以時間為函數(shù)，測定專一結合。結合達到平衡的時間決定于速度常數(shù)和受體及配基的濃度。其特異性結合的求法同上所述，以時間對In (Beq/Beq-Bt)作圖，其中Beq代表結合達到平衡時，Bt為各時間的特異結合，并進行直線回歸得結合動力學圖（見表2.33）。以時間對In(Bt/Beq)作圖，并作直線回歸，可得解離動力學圖。,4、競爭性抑制實驗 主要目的為測定IC50和Ki。 IC50是指抑制50%結合的抑制劑濃度，K