1、體內(nèi)藥物分析的樣品處理和方法驗(yàn)證，1。為什么要處理生物樣本？2.有什么生物樣本？3.樣品處理方法是什么？他們各自的特點(diǎn)。4.如何驗(yàn)證分析方法？5.參考標(biāo)準(zhǔn)是什么？2.生物樣品預(yù)處理的目的如下：1 .藥物進(jìn)入人體后，被吸收、分配和代謝，然后排出體外。在體液、組織和排泄物中，不僅有游離(原型)藥物，還有藥物代謝物、藥物-蛋白質(zhì)綴合物、藥物或其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸苷、硫酸酯綴合物等。這需要在分離后確定。三一。治療的目的，2 .生物樣品的培養(yǎng)基成分很復(fù)雜。例如，血清不僅含有高分子蛋白質(zhì)和低分子有機(jī)化合物如糖、脂肪和尿素，還含有無(wú)機(jī)化合物如鈉、鉀和氯。這些成分會(huì)嚴(yán)重影響

2、測(cè)定的準(zhǔn)確度和靈敏度，同時(shí)污染儀器。因此，為了保護(hù)儀器，提高靈敏度，保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。超過(guò)4%、5%和60%的能源和費(fèi)用用于樣品預(yù)處理。生物樣本包括各種體液和組織，但事實(shí)上，最常用的是血液(全血、血漿和血清)、尿液、糞便和唾液。在某些特殊情況下，選擇牛奶和腦脊液。6、2、生物樣品的種類，全血不易保存，而且血細(xì)胞含有較多的干擾物質(zhì)，影響測(cè)定，因此全血很少用于測(cè)定藥物濃度。僅適用于血漿藥物濃度過(guò)低或波動(dòng)較大且難以控制的藥物，如環(huán)孢素A。血液中藥物濃度的測(cè)定通常是指血漿或血清中藥物濃度的測(cè)定，而不是含血細(xì)胞的全血中藥物濃度的測(cè)定。將收集的血液放入含有抗凝劑(如肝素和

3、乙二胺四乙酸)的試管中，混合，以3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心，分離血細(xì)胞。上清液是血漿。8，2血漿，9，血漿中所含物質(zhì)的類型和比例，收集不含任何抗凝血?jiǎng)┑难?，然后在室溫下放?5-30分鐘，然后離心分離上清液。與血漿相比，血清顏色較淺，纖維蛋白含量較少，因此更容易處理，血漿和血清中藥物濃度的測(cè)定值通常是相同的。10，3血清，一般認(rèn)為當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，血漿中的藥物濃度與作用部位的藥物濃度密切相關(guān)，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內(nèi)(靶器官)的狀態(tài)，因此血漿濃度可以作為作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。血漿和血清可在冷凍條件下穩(wěn)定保存，一般在-20，也可在-80下長(zhǎng)期保存，是生物樣品

4、檢測(cè)中最常用的樣品。尿液的主要成分是水、尿素和無(wú)機(jī)鹽。收集尿樣后，通常添加防腐劑進(jìn)行保存。體內(nèi)藥物清除主要通過(guò)尿液排出，藥物可以原型、代謝物及其結(jié)合物的形式排出。尿液中的藥物濃度很高，但尿液濃度受尿量的影響，尿量通常變化很大。排入尿液的藥物總量應(yīng)在一定時(shí)間內(nèi)確定。尿液和唾液中所含成分相對(duì)簡(jiǎn)單易得，但唾液濃度與血漿游離藥物濃度之間只有少數(shù)藥物存在相關(guān)性，在實(shí)踐中很少使用。當(dāng)藥物血漿結(jié)合率高時(shí)，唾液中的藥物濃度極低且難以檢測(cè)。13，5唾液，除取樣后立即分析外，為了防止藥物變化，應(yīng)：短期保存，但4冷藏；長(zhǎng)期保存，可在-20冷凍，不要反復(fù)凍融，必要時(shí)添加酶抑制劑和抗氧化劑。14，生物樣品的保存：應(yīng)考慮

5、生物樣品的類型、受試藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法。15，3。常見(jiàn)的治療方法：1 .蛋白質(zhì)PPT 2的沉淀。液-液萃取LLE 3。固相萃取固相萃取16，1。蛋白質(zhì)沉淀，通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀法加入水溶性有機(jī)溶劑，可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性常用的有機(jī)溶劑有乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等。當(dāng)血漿或血清與有機(jī)溶劑的體積比為1:3時(shí)，可去除90%以上的蛋白質(zhì)，低溫高速離心10分鐘，以16000轉(zhuǎn)/分鐘的速度可使沉淀的蛋白質(zhì)完全沉淀。在實(shí)際應(yīng)用中，取血漿50uL，加入有機(jī)溶劑500uL，離心后取上清液注射；如果沉淀后信號(hào)不好，試著改變有機(jī)溶劑或在沉淀過(guò)程中加入酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)酸堿度，這可能對(duì)結(jié)果有很大影響；常用的酸和

6、堿有：鹽酸、甲酸、乙酸、氨水等。17，優(yōu)點(diǎn)：易于操作，是方法開(kāi)發(fā)中首先要考慮的。缺點(diǎn)：僅用于樣品中高濃度藥物的測(cè)定；處理后，樣品中仍有許多干擾物質(zhì)，會(huì)干擾結(jié)果。殘留的雜質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱，污染儀器。18，中性鹽可以用蛋白質(zhì)代替水，使蛋白質(zhì)脫水和沉淀。常用中性鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽和檸檬酸鹽等。鹽析法和有機(jī)溶劑萃取法常用，藥物回收率較高。加入中性鹽、19、20、20和強(qiáng)酸。當(dāng)酸堿度低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在。加入強(qiáng)酸會(huì)與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽并沉淀。常用的強(qiáng)酸有：10%三氯乙酸等。血清與強(qiáng)酸的比例為1:0.6，可通過(guò)高速離心去除蛋白質(zhì)。在酸性條件下分解的藥物不能用這

7、種方法去蛋白。當(dāng)酸堿度高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，金屬陽(yáng)離子與蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電荷的羧基形成不溶性鹽并沉淀。常用的沉淀劑有硫酸銅、硫化鋅、氫氧化鈉等。含藥血清與沉淀劑的比例為1:2，經(jīng)高速離心分離后得到上清液。21，加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑，在測(cè)定某些具有不穩(wěn)定酸和強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物時(shí)經(jīng)常需要酶解。當(dāng)測(cè)定尿液中的藥物濃度時(shí)，由于尿液中的藥物主要以結(jié)合物的形式被排除，它們比原型藥物更具極性，并且不容易被有機(jī)溶劑提取。酶水解是常用的。22、酶解、超速離心平衡透析主要用于測(cè)定血漿中游離藥物的濃度和藥物的血漿蛋白結(jié)合率。其他一些去除蛋白質(zhì)的方法：藥物在體內(nèi)被吸收，需要通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此大多數(shù)藥物具有一定的脂溶

8、性，而生物樣品中的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)都是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)，因此根據(jù)藥物分子和基質(zhì)的極性差異，可以用合適的有機(jī)溶劑提取藥物，這樣可以一次去除大部分雜質(zhì)。24，2。對(duì)于采用液-液萃取法的LLE，有機(jī)溶劑應(yīng)穩(wěn)定、易揮發(fā)、毒性低且與水相不混溶。常用的有機(jī)溶劑有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲基醚和氯仿。當(dāng)應(yīng)用該方法時(shí)，有必要考慮所選有機(jī)溶劑的特性、藥物的特性、有機(jī)溶劑相與水相的體積比以及水相的酸堿度。酸性藥物解離：AH H2O A- H堿性藥物解離：B H2O B-OH藥物的解離常數(shù)pKa是藥物解離50%時(shí)溶液的酸堿度。25，藥物的提取程度主要取決于水相的酸堿度。對(duì)于堿性藥物，最好的酸堿度是比PKA

9、高1-2個(gè)單位；對(duì)于酸性藥物，它比pKa值低1-2個(gè)單位；這樣，90%的藥物可以以非電離的形式存在，這使得它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中更易溶解。常用于調(diào)節(jié)酸堿度的物質(zhì)有甲酸、乙酸、鹽酸或氨水、氫氧化鈉等。水相的酸堿度影響液-液萃取的最關(guān)鍵因素，26。有兩種特定的提取模式，直接提取和反向提取。優(yōu)點(diǎn)：樣品提取后，可以去除大部分雜質(zhì)，相對(duì)“干凈”；可以通過(guò)蒸發(fā)和再溶解有機(jī)溶劑來(lái)濃縮樣品。大多數(shù)藥物都是脂溶性的，并且具有廣泛的缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜；當(dāng)提取血漿時(shí)，血漿中的脂質(zhì)將被一起提取。使用質(zhì)譜檢測(cè)器時(shí)，離子源處會(huì)產(chǎn)生基體效應(yīng)，嚴(yán)重干擾質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性！27、在方法探索中，一般是使用上述溶劑，并行操作，同

10、時(shí)提取，加入空白對(duì)照，比較結(jié)果，判斷哪種有機(jī)溶劑具有最佳提取效果；如果都不理想，可以將上述溶劑混合后再次使用，可以調(diào)整1:1、1:2和1:3的使用比例；在探索合適的提取溶劑時(shí)，可以根據(jù)藥物的酸堿性，嘗試加入一些酸、堿或離子對(duì)試劑，以提高回收率；在提取過(guò)程中，必須嚴(yán)格控制酸堿度。對(duì)于兩性藥物，應(yīng)使用緩沖溶液，以確保穩(wěn)定和可重復(fù)的提取回收率。例如，28、29:取100微升血漿樣品、20微升同位素內(nèi)標(biāo)、50微升甲酸、1微升正己烷和3微升叔丁基甲基醚，渦旋10分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，在-80冷凍10分鐘，倒出上層有機(jī)層，在40水浴中用氮?dú)獯蹈?，?50微升中用丙酮溶解，在50微升中用丹磺

11、酰氯的丙酮溶液溶解。在40水浴中孵育20分鐘，磷酸鹽緩沖液2mL叔丁基甲基醚4mL，渦旋振蕩10分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，在-80冷凍10分鐘，倒出上層有機(jī)層，在40水浴中用氮?dú)飧稍?，再溶解流?dòng)相。固相萃取是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的樣品預(yù)處理技術(shù)。由液-固萃取和液相色譜結(jié)合而成。樣品的分離、純化和富集主要是通過(guò)固相填料對(duì)樣品組分的選擇性吸附和解吸過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。主要目的是減少樣品基體干擾，提高檢測(cè)靈敏度。固相萃取固相萃取的基本原理和方法：固相萃取技術(shù)是基于液固色譜理論，利用選擇性吸附和選擇性洗脫來(lái)富集、分離和純化樣品。它是一個(gè)包括液相和固相的物理萃取過(guò)程；它也可以被視為一個(gè)簡(jiǎn)單的

12、色譜過(guò)程。常用的方法是將液體樣品通過(guò)吸附劑，保留其中的被測(cè)物質(zhì)，然后選擇合適濃度的溶劑洗去雜質(zhì)，再用少量的好溶劑洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離、純化和濃縮的目的。它還可以選擇性地吸附干擾雜質(zhì)，讓被測(cè)物質(zhì)流出。31，32，33，萃取柱可使用一次以防止交叉污染！固相萃取通常有五個(gè)步驟：活化甲醇/乙腈以潤(rùn)濕柱和活化填料；用平衡水或適當(dāng)?shù)木彌_溶液沖洗平衡柱；將樣品轉(zhuǎn)移至色譜柱，并泵出廢液；用水或緩沖溶液沖洗，以最大程度地消除干擾；洗脫：用少量溶劑洗脫被測(cè)物質(zhì)并收集。34，1。正相色譜原理2。反相色譜原理3。離子交換原理。根據(jù)原則分類：36，37。固相萃取法的優(yōu)點(diǎn)：1 .不乳化；2.應(yīng)用范圍廣；3.提取

13、效率高；4.方便快捷，可一次提取分離多種化合物；5.溶劑消耗更少；6.易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；7.離子交換固相萃取利用離子交換原理，這與色譜柱按極性分離的原理不同。當(dāng)一起使用時(shí)，它可以最大限度地分離藥物和消除干擾。目前，商業(yè)化的固相萃取柱已被廣泛使用。三種方法的比較：藥物化學(xué)衍生化的目的是使藥物具有可分離性；提高檢測(cè)的靈敏度；增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性；提高分離旋光異構(gòu)體的能力。所有分子中含有活性氫的藥物都可以進(jìn)行化學(xué)衍生，例如，含有官能團(tuán)如-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH的藥物都可以進(jìn)行衍生。39，4。高效液相色譜中的化學(xué)衍生，包括柱前衍生和柱后衍生。在柱前衍生化分析之前，應(yīng)盡可能地提取和分離藥

14、物，然后衍生化以防止其他雜質(zhì)，40，41，定量下限為10 pg！分析和確定待測(cè)藥物的物理和化學(xué)性質(zhì)及其在生物體中的存在的目的和要求。生物樣品的類型和預(yù)處理方法。實(shí)驗(yàn)室條件。42.體內(nèi)藥物分析方法的建立。1.光譜分析。2.色譜。毛細(xì)管電泳。4.免疫測(cè)定。5.同位素方法。43.體內(nèi)藥物分析方法大致可分為以下幾類：44。建立體內(nèi)藥物高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析方法的一般過(guò)程：2.使用標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品，掃描質(zhì)譜條件；3.選擇色譜柱和流動(dòng)相，探索合適的液相條件；4.根據(jù)樣品矩陣，制備模擬生物樣品，選擇相應(yīng)的樣品處理方法，并對(duì)處理后的樣品進(jìn)行分析；5.調(diào)整樣品處理方法或液相條件，進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)；6.根據(jù)檢測(cè)目

15、的，設(shè)定定量范圍，研究方法。方法學(xué)驗(yàn)證，生物樣品測(cè)定的關(guān)鍵是方法學(xué)的確認(rèn)。方法學(xué)確認(rèn)是整個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)。這是藥代動(dòng)力學(xué)研究的特點(diǎn)，不同于其他藥理學(xué)和毒理學(xué)研究。所有藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果都依賴于生物樣品的測(cè)定，只有可靠的方法才能得到可靠的結(jié)果，因此必須對(duì)已建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。此外，應(yīng)在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)量控制，并應(yīng)制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)量質(zhì)量控制樣品，以確保檢測(cè)方法的可靠性。45，46，47，生物分析方法驗(yàn)證指南-EMEA，48，49，50，4。校準(zhǔn)曲線，結(jié)果要求校準(zhǔn)曲線應(yīng)至少包括六個(gè)濃度點(diǎn)、一個(gè)矩陣空白和一個(gè)控制零點(diǎn)(僅供參考，不包括在校準(zhǔn)曲線的計(jì)算中)，必要時(shí)可進(jìn)行雙重測(cè)量

16、；每個(gè)濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度應(yīng)在85%-115%之間，精密度應(yīng)小于15%，定量下限應(yīng)在80%-120%和20%之間；不符合要求的濃度點(diǎn)可以不計(jì)算，但至少有75%的濃度點(diǎn)符合要求；在方法驗(yàn)證期間，應(yīng)提供至少三條合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以納入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。51，52，質(zhì)量控制樣品，QC，通過(guò)在生物基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的模擬生物樣品，可用作方法驗(yàn)證中的調(diào)查樣品和樣品測(cè)定中的方法質(zhì)量控制。低濃度質(zhì)控品(低質(zhì)控品)濃度不應(yīng)超過(guò)LOLQ的3倍。中等質(zhì)量濃度通常是定量范圍內(nèi)的中等濃度。高質(zhì)量控制(高質(zhì)量控制)的濃度應(yīng)至少為ULOQ的75%。質(zhì)量控制樣品建議由獨(dú)立人員一次性制備。在樣品被注射和分析后，它們被分成包裝并冷凍保存。每次取足夠數(shù)量的樣品使用，其余的丟棄。53，54，55，8。穩(wěn)定性穩(wěn)定性，8.1分析物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液的穩(wěn)定性，以及內(nèi)標(biāo)物8.2樣品冷凍/解凍的第三溶液的穩(wěn)定性，冷凍/解凍的短期穩(wěn)定性，解凍后的8.3樣品，解凍后的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，8.4樣品冷凍的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，8.5樣品中處理過(guò)的樣品溶液的長(zhǎng)期穩(wěn)定