1、李成仁 組織胚胎學(xué)教研室 Tel：752220，Email：,第四章 原位雜交技術(shù),形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),1,中心法則,免疫組織化學(xué),？,核酸分子原位雜交,2,一、核酸分子原位雜交的基本概念,(一)定義 用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交, 從而對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。,簡(jiǎn)稱原位雜交,3,(二) 基本原理,堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,4,加熱變性,雜交反應(yīng),酶標(biāo)記的抗探針標(biāo)記物的抗體,酶顯色反應(yīng),帶標(biāo)記物的探針,5,定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開(kāi) 成兩條單鏈的過(guò)程。 方法：過(guò)量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、 甲酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。

2、,(三)DNA變性(denaturation),本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,6,解鏈曲線,熱變性,變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱熔解溫度, Tm)。其大小與G+C含量成正比。,熔解溫度(, Tm),Tm=（G+C）%0.41+69.3,7,在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。 熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，又稱為退火。,DNA復(fù)性,復(fù)性,RNA,DNA,8,(一)定義：,是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片段，是在原位雜交中用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定DNA或RNA順序定位的特殊試

3、劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上,二、探針（probe）,9,(二)探針的分類,根據(jù)探針的核酸性質(zhì)分為,DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針、寡核苷酸探針,10,1. cDNA(complementary DNA), 克隆于質(zhì)粒中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡 較不易被降解 標(biāo)記方法可靠易行,優(yōu)點(diǎn),互補(bǔ)于mRNA的DNA分子 （長(zhǎng)度為數(shù)百-數(shù)千堿基對(duì)）,11,優(yōu)點(diǎn)： 雜交效率比DNA探針高 在檢測(cè)mRNA時(shí)所形成的RNA-mRNA雜交體比DNA-mRNA雜交體穩(wěn)定 缺點(diǎn)：容易受RNA酶的污染而被降解,2. RNA,RNA是單鏈分子（探針長(zhǎng)度50-300堿基對(duì)）,1

4、2,根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列在DNA合成儀上合成 優(yōu)點(diǎn)：形成雜交體快速(序列短，雜交時(shí)易于穿透) 缺點(diǎn)：特異性較低（短鏈和簡(jiǎn)單）,3. 寡核苷酸,短鏈探針(長(zhǎng)度10-50個(gè)核苷酸),13,1. 標(biāo)記物 3H、32P、35S、125I等。,(三)探針的標(biāo)記,(1)放射性標(biāo)記物,特點(diǎn)：敏感性高 半衰期，放射性污染，成本高，耗時(shí)長(zhǎng),Vermot J. 2000. Endocrinology.,Xie HR et al. 2007. PANS,35S,35S,14,(2)非放射性標(biāo)記物 生物素、熒光素、地高辛素、辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶等。,特點(diǎn)：性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，成本低、耗時(shí)短，標(biāo)記探針可較長(zhǎng)時(shí)間的保

5、存和使用,15,特點(diǎn)：敏感性與放射性核素標(biāo)記的探針相似 較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)間 定位準(zhǔn)確，雜交背景好,地高辛（Digoxigenin 簡(jiǎn)寫(xiě)Dig-） 類固醇半抗原分子 人及多種動(dòng)物體內(nèi)不存在類似的物質(zhì)，無(wú)交叉反應(yīng),16,17,地高辛標(biāo)記探針的顯色檢測(cè),常用免疫酶學(xué)顯色檢測(cè)方法有兩類： Dig-HRP檢測(cè)系統(tǒng) 以DAB/H2O2為底物，結(jié)果為棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2為底物，結(jié)果為藍(lán)色。 Dig-AKP檢測(cè)體系 以BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀。,18,Diao HL. 2007. Fertil 雜交液的量要適當(dāng)，以1020l/每張切片為宜,1. 探針準(zhǔn)備,36

6、,理論熱變性溫度：9095 甲酰胺法：常規(guī)的加入3050%甲酰胺于雜交液中 每增加1%，Tm值降低0.72，降至37-40 為宜 注意：在每次變性后，都需要將樣品用冰迅速冷卻，以保持變性后單鏈狀態(tài)。,當(dāng)靶核酸或探針為DNA時(shí)，雜交前需要變性為單鏈,2. 探針和靶核酸變性,37,探針預(yù)變性的探針 高濃度鹽類(檸檬酸鈉)增加雜交體的穩(wěn)定性 甲酰胺可降低解鏈溫度 硫酸葡聚糖對(duì)DNA有濃縮作用，可提高雜交的反應(yīng)速度10倍以上，但不影響探針的洗脫強(qiáng)度 牛血清白蛋白和鮭魚(yú)精DNA或RNA用于阻止探針與非特異位點(diǎn)或非目標(biāo)DNA雜交。,3. 雜交液的組成,38,方法：雜交液滴于切片上，加蓋硅化的蓋玻片。 雜交

7、的溫度：在Tm-25左右，大約在3060之間 時(shí)間：1620小時(shí)，一般過(guò)夜。 PH：6.57.5,含50%甲酰胺、鹽濃度0.75mol/L左右時(shí)，雜交溫度： DNA探針是42 RNA探針是50-55 寡核苷酸探針是37,4. 溫度、時(shí)間和PH,39,目的：盡可能洗去未雜交或非特異性吸附的探針。 方法：系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 RNA探針雜交后漂洗液中的可加入RNA酶 原則：是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高,(五)雜交后處理,40,(六)雜交體的檢測(cè) 生物素標(biāo)記的探針 地高辛標(biāo)記的探針,酶標(biāo)記卵白抗生物素抗體,酶標(biāo)記鏈霉抗生物素抗體連接,酶標(biāo)記抗地高辛抗體,標(biāo)記酶：HRP、AlP

8、,41,42,43,44,(七)原位雜交詳細(xì)步驟,1、二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。DEPC水洗2次， DEPC-PBS洗2次，5分鐘 2、DEPC-PBS處理的Triton-X100處理15分鐘 3、DEPC-PBS洗2次，5分鐘 4、TE緩沖液稀釋的蛋白酶K（5-20g/m l）37孵育1520min,45,5、用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗1min終止蛋白酶K的消化，DEPC-PBS洗2次，5分鐘 6、DEPC-PBS-4%多聚甲醛后固定 10-15分鐘 7、DEPC-PBS洗2次，5分鐘 8、2SSC洗5分鐘 9、不含探針的雜交液中37孵育2h,46,10、2SSC洗5分

9、鐘 11、含探針雜交液中37(42-55)孵育18h 12、1SSC在室溫下速洗， 1SSC在55 水浴搖洗，215min，0.5 SSC在55 水浴搖洗215min， 0.5 SSC在室溫下洗10min 13、放射自顯影或酶顯,47,目的：保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性 標(biāo)本對(duì)照、探針對(duì)照、雜交體對(duì)照、檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)照 陰性對(duì)照：排除非特異性雜交等因素造成的假陽(yáng)性 陽(yáng)性對(duì)照：證明雜交步驟及試劑可靠性 對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)置愈多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性就愈大。 注意：每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,四. 對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置,48,常用的實(shí)驗(yàn)對(duì)照 (1)標(biāo)本對(duì)照：選用已知為陽(yáng)性或陰性的組織 (2)空白實(shí)驗(yàn): 無(wú)探針的雜

10、交液進(jìn)行雜交 (3)選用其他生物學(xué)方法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn) 提取標(biāo)本DNA和RNA進(jìn)行Southern和Northern印記雜交、qPCR、RT-PCR等。,49,（4）RNA酶或DNA酶預(yù)先處理標(biāo)本后雜交反應(yīng) （5）選用標(biāo)記的非特異性（載體）序列或不相關(guān)的核酸探針進(jìn)行雜交。 （6）探針?lè)跤蟮臋z測(cè)系統(tǒng)對(duì)照,50,1. 標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)不佳 取材的標(biāo)本不新鮮，核酸有不同程度的降解 雜交預(yù)處理中蛋白酶消化不當(dāng)所致 雜交溫度較高、孵育時(shí)間長(zhǎng)易造成切片的飄浮或脫片,五. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能的問(wèn)題和原因,51,2. 雜交信號(hào)弱 探針鏈太長(zhǎng)不易深入細(xì)胞 探針的標(biāo)記不好 靶序列暴露程度不佳 探針和（或）靶序列的變性條件欠佳

11、,52,3. 無(wú)雜交信號(hào) 標(biāo)本內(nèi)無(wú)靶序列的存在 標(biāo)本內(nèi)存在靶序列，因?qū)嶒?yàn)?zāi)硞€(gè)環(huán)節(jié)的失誤導(dǎo)致后者可能降解,53,4. 非特異性著色 探針特異性 組織細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性酶 組織細(xì)胞內(nèi)的某些成分與檢測(cè)系統(tǒng)的抗體非特異性結(jié)合,54,基本實(shí)驗(yàn)過(guò)程總結(jié),放射自顯影,免疫細(xì)胞化學(xué),樣品制備,切片,探針制備、標(biāo)記,純化,通透處理,變性, 原位雜交 ,雜交體探測(cè)：,小結(jié),55,Thank you！,56,常用試劑,14%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA） 配法：稱取40g PFA溶于裝有500ml DEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌至6065，使成乳白色懸液。用1.0mol/L

12、的NaOH調(diào)pH值至7.0，使呈清亮狀，再加入約500ml 2PBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中），可再檢測(cè)一下pH，過(guò)濾后定容至1000ml，室溫或4保存?zhèn)溆谩?57,注意：配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對(duì)粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；加熱時(shí)，溫度不宜過(guò)高，常為6065，否則，PFA降解失效；配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過(guò)久的液體，固定效果下降，建議盡早使用。,58,2、雜交用液 1)SSC (Standard Saline Citrate) 通常配成10，20，50的儲(chǔ)備液，如下：,59,先稱取上述兩種試劑，溶于約800ml ddH2O中，滴加1