1、.,HPLC-NMR聯(lián)用技術(shù),.,目錄,一、HPLC-NMR出現(xiàn)的意義 二、HPLC-NMR的發(fā)展進(jìn)程 三、HPLC-NMR裝置 四、HPLC-NMR在實(shí)際應(yīng)用中面臨的主要技 術(shù)問題及解決方法 五、操作模式和技術(shù) 六、HPLC-NMR的應(yīng)用 七、HPLC-NMR的前景展望,.,一、HPLC-NMR出現(xiàn)的意義,高效液相色譜是分析復(fù)雜有機(jī)物、藥物和生物大分子等混合物的一種重要手段,但如果使用通常的檢測器如紫外、熒光、電化學(xué)等檢測器只能得到非常有限的分子結(jié)構(gòu)信息。 NMR能夠提供大量的分子結(jié)構(gòu)信息，但NMR分析方法要求樣品為純品，對于復(fù)雜的混合物，因?yàn)镹MR信號的互相覆蓋，單純靠NMR譜則顯得無能為

2、力。 如果在核磁儀器前加上一級色譜分離設(shè)備把直接樣品分離后再送人NMR中掃描，就可以大大簡化分析程序，提高樣品分析速度，這就是色譜分離技術(shù)與NMR波譜儀結(jié)合并且日趨普及的原因。,.,二、HPLC-NMR的發(fā)展進(jìn)程,在70年代末，第一次有人將HPLC-NMR聯(lián)用 80年代末HPLC-NMR技術(shù)才作為一種有效的分析手段而得到了承認(rèn) 最近幾年HPLC-NMR的分析方法迅速發(fā)展并取得了巨大的成功，已經(jīng)被證明為生物化學(xué)和藥物化學(xué)分析中最重要的分子結(jié)構(gòu)鑒定方法之一,.,三、HPLC-NMR的裝置,典型的HPLCNMR聯(lián)用裝置是由泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測器組成LC系統(tǒng)，通過一條22 .5m長的特制毛細(xì)管

3、連接到NMR液相探頭上?？梢詫MR 視為HPLC 的特殊檢測器，其化學(xué)位移、積分強(qiáng)度和譜線分裂情況能提供豐富的定量定性信息。位于NMR探頭底部的閥用來控制NMR測試是在停流狀態(tài)下還是在連續(xù)流動狀態(tài)下進(jìn)行。,.,NMR探頭是聯(lián)用裝置中最關(guān)鍵的部分。傳統(tǒng)的NMR探頭樣品管在一個與測量線圈相連的玻璃插件內(nèi)旋轉(zhuǎn)。 HPLC-NMR探頭由一個不旋轉(zhuǎn)的直接固定在射頻線圈上的玻璃管構(gòu)成，它處于傳統(tǒng)探頭玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管內(nèi)徑為2，3或4 mm。玻璃壁長度至少超過質(zhì)子檢測線圈(18 mm)，并與之平行，同時向兩端逐漸變細(xì)。由于射頻線圈直接固定在檢測池的玻璃管上，NMR線圈的體積與試樣體積比，即所謂的填充

4、因子(filling factor)接近最佳值，這種類型的NMR測定探頭原則上是最靈敏的。,.,（一）HPLC高濃度溶劑的NMR信號抑制 首先，大多數(shù)HPLC體系采用反相柱，兩元或三元體系作為流動相，這些強(qiáng)溶劑峰使得被分析成分的NMR信號變差，且強(qiáng)的溶劑峰所伴隨的13C 衛(wèi)星峰也會干擾有用信號的觀測。 其次，實(shí)驗(yàn)過程中流動相溶劑梯度會引起某些溶劑峰化學(xué)位移的移動。,四、HPLC-NMR在實(shí)際應(yīng)用中面臨 的主要技術(shù)問題及解決方法,.,常用的方法有： 采用氘代溶劑，價格昂貴，但近年來由于毛細(xì)管HPLC的發(fā)展，溶劑的消耗量大為減少，實(shí)驗(yàn)中有可能使用氘代試劑作洗脫液，不必使用溶劑抑制。 通過不同頻率通

5、道進(jìn)行多重溶劑峰預(yù)飽和。 脈沖梯度場的相位離散而消除溶劑干擾。 使用WET-序列。,.,（二） 避免損害色譜分析的分辨率 與HPLC的常規(guī)用量相比，NMR檢測所需的樣品量是非常大的。在HPLC-NMR操作中，較大的HPLC進(jìn)樣量和較長的HPLC流動時間實(shí)際上造成了色譜峰的展寬。 理想的進(jìn)樣量應(yīng)該是盡可能小地來取得好的HPLC分辨率，同時又應(yīng)該盡可能大地來滿足NMR檢測的需要。這個問題可以通過選擇最佳進(jìn)樣量及優(yōu)化其它操作條件來部分地解決。,.,（三）NMR高靈敏度的需要 NMR的靈敏度大大低于HPLC的其它常規(guī)檢測器(如：紫外檢測器等)靈敏度，如何解決這個矛盾是HPLC-NMR技術(shù)發(fā)展的主要難題

6、之一。高場探頭性能的不斷改進(jìn)，大大提高了NMR的檢測靈敏度，除此外，目前還可采取四個個途徑： (1)采取適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞健＃ê罄m(xù)講述） 例如采用駐流方式可以大大提高系統(tǒng)的靈敏度。 (2)使用高頻儀器。 隨著NMR技術(shù)的發(fā)展，儀器的頻率在不斷的提 高，現(xiàn)在已出現(xiàn)了800MHz以上的儀器，靈敏度較以往的儀器有了大幅度的提高。,.,(3)利用SPC等方法濃縮樣品 超臨界流體是指處于臨界溫度、臨界壓力狀態(tài)下的物質(zhì)，這時其物理性質(zhì)介于氣體和液體之間。超臨界流體技術(shù)能夠彌補(bǔ)氣相和液相分離存在的缺點(diǎn)，且能兼顧兩者的優(yōu)點(diǎn)。 作為流動相的CO2具有價廉、安全和易獲取等優(yōu)點(diǎn)，對低極性或中極性物質(zhì)具有較好的溶解性，適

7、合分析熱敏感組分 。同時，作為流動相的CO2 沒有氫信號，因而不需要考慮水峰抑制問題?？梢砸淮涡酝瓿蓮臉悠返姆蛛x純化到蜂的檢測、結(jié)構(gòu)測定和定量分析，并提供混合物的組成和結(jié)構(gòu)信息，從而提高了研究效率和靈活性。,.,(4)降低探頭溫度 利用高溫超導(dǎo)薄膜材料而制成的超導(dǎo)低溫探頭，當(dāng)樣品溫度由溫控單元維持時，采用閉環(huán)或開環(huán)制冷系統(tǒng)使超導(dǎo)線圈溫度降到25K，消除了譜圖的電噪聲，這相對于常規(guī)5 mm探頭而言，其潛在靈敏度可以提高810倍。,.,總的來看，目前HPLC-NMR主要有兩種可供選擇的操作方式，分別是連續(xù)流方式和駐流方式。其中駐流方式又主要分為時間分割駐流方式、脫機(jī)駐流方式和uv檢測自動控制NMR

8、取樣。下面對其進(jìn)行一一詳細(xì)討論。,五、操作模式和技術(shù),.,（1）連續(xù)流動模式 HPLC的流動是連續(xù)的，不受NMR取樣的影響，當(dāng)每一組分由HPLC流經(jīng)NMR檢測池時儀器時就會掃描出這個組分的譜圖。使用這種方法可以在很短的時間內(nèi)完成樣品分析并得到各組分分子結(jié)構(gòu)方面的信息。因此連續(xù)流操作方式在一些要求較快得出檢測結(jié)果的分析中得到了應(yīng)用。但是這種模式一般只適用于 1H和 19F測試。,.,（2）駐流模式： 駐流模式：讓溶液停留于檢測池中進(jìn)行測試，當(dāng)所需要組分的保留時間已知，或者HPLCNMR采用靈敏的在線檢測器時，可以采用這種方法。 時間分割駐流方式。這是最早使用的一種駐流操作方式。具體方法是：通過紫

9、外檢測器確定了色譜峰位置之后，在適當(dāng)?shù)臅r間停止色譜流動，使色譜峰準(zhǔn)確地停留在NMR檢測池中，同時使用NMR進(jìn)行較長時間的掃描(可達(dá)數(shù)小時)，并且根據(jù)需要可以作COSY、TOCSY等二維NMR譜圖。一個譜峰掃描完畢后，可以繼續(xù)色譜流動。這樣就相當(dāng)于將整個色譜流動過程分為若干段，一段段地進(jìn)行NMR分析。 就目前來看，這種操作方式的主要缺點(diǎn)是：由于色譜流動相階段性停止，大大增加了分離時間，從而可能會使色譜峰展寬，分辨率下降。,.,脫機(jī)駐流方式 脫機(jī)駐流操作方法是在色譜分離的過程中，將各個色譜峰的一部分轉(zhuǎn)移到不同毛細(xì)管(capillary loops)中然后再分別進(jìn)人NMR檢測池進(jìn)行掃描分析。在整個過

10、程中，色譜峰并沒有任何停頓，所以就解決了使用“時間分割”駐流方式所帶來的色譜峰展寬問題。,., UV檢測器控制NMR取樣 使用這種方式進(jìn)行操作必須有相應(yīng)的軟件支持。在這種操作方式中，可以選擇手動和自動兩種模式。當(dāng)選用自動方式時，系統(tǒng)會通過UV檢測器監(jiān)測HPLC流出的較大色譜峰，并自動取樣進(jìn)人NMR中進(jìn)行掃描。如果選用手動方式，儀器可按用戶設(shè)置的峰位置、大小等參數(shù)有選擇地對各組分進(jìn)行取樣、掃描。 這種操作方法自動化程度高，使用簡便，目前正處于發(fā)展之中。,.,六、HPLC-NMR的應(yīng)用,HPLC-NMR在藥物研究中的應(yīng)用主要是新藥雜質(zhì)(副反應(yīng)產(chǎn)物與降解產(chǎn)物)結(jié)構(gòu)測定、植物提取物中具生理活性化合物的

11、結(jié)構(gòu)測定、藥物構(gòu)型研究、藥物代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與構(gòu)型研究、藥物在體液中的毒性與藥代動力學(xué)研究以及微生物代謝物研究。,.,（一）在藥物代謝研究中的應(yīng)用 PFoxall等用HPLCNMR研究了異環(huán)磷酰胺的毒性和代謝物。用1HNMR觀察尿液中各種指標(biāo)的變化，包括尿糖、甘氨酸、丙氨酸、組胺酸、乳酸、乙酸鹽、三甲胺丁二酸鹽的上升和馬尿酸鹽、檸檬酸鹽的下降。結(jié)合 31PNMR譜，鑒定出3種代謝物。 用Bruker DKX 500 NMR儀，NMR探頭體積120 L，測1H譜時用門控預(yù)飽和技術(shù)來達(dá)到水和乙腈雙溶劑抑制。,.,（二）在天然產(chǎn)物化學(xué)中的應(yīng)用 在線或收集分析鑒定混合物結(jié)構(gòu)JDKoning 等以在線痕量

12、富集HPLCNMR鑒定了蛇麻草提取物中蛇麻草苦昧酸。YZhao等用停流HPLCNMR研究了紫杉科植物提取物的成分，分離并鑒定出7種木酚素。,.,（三）在食品化學(xué)中的應(yīng)用 采用HPLCNMR技術(shù)鑒別食品中有關(guān)成分，作為質(zhì)量控制、品質(zhì)評定應(yīng)用于食品中糖類(酒、果汁)、水質(zhì)、保健食品等分析。 IDuarte等 應(yīng)用LCNMRMS技術(shù)測定了啤酒中糖類物質(zhì)，糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)由NMR單獨(dú)來確定時，會產(chǎn)生嚴(yán)重的峰重疊，而采用LCNMRMS則能夠快速測定糊精單體的聚合程度。A1mmen等 馴利用HPLCNMRMS技術(shù)確認(rèn)蘋果皮中槲皮素糖苷、根皮素糖苷的含量。,.,（四）在雜質(zhì)研究中的應(yīng)用 Mistry等 j用H

13、PLC-NMR確定了氟替卡松丙酸鹽4個已知的二聚體雜質(zhì)，雜質(zhì)存在水平為006 一09。 HPLC條件為Bruker LC22泵，可變波長紫外檢測器(239 nm檢測)，Inertsil ODS-2色譜柱、柱溫40，NMR條件為Broker AMX-6OO NMR儀、NMR探頭內(nèi)徑mm、體積20L和用脈沖序列抑制溶劑峰信號。,.,此外，HPLC-NMR聯(lián)用技術(shù)在生物分析、環(huán)境監(jiān)測、微生物代謝物研究等方面也有應(yīng)用。,.,HPLCNMR聯(lián)用技術(shù)解決了醫(yī)藥、聚合物和生物醫(yī)學(xué)不同領(lǐng)域的實(shí)際問題。 其關(guān)鍵在于巧妙而完美的聯(lián)用技術(shù), 這種聯(lián)用技術(shù)包括適當(dāng)?shù)慕涌诩夹g(shù)，其要兼顧HPLC和NMR各組成部分的性能和參數(shù)的最佳化，從而使整個系統(tǒng)更為實(shí)用更為完美 。 通過優(yōu)化連續(xù)流動探頭的設(shè)計，可進(jìn)一步降低N