1、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))原理 PCR 是體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成： 即在高溫（95）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（3755）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工

2、合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過2530個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106107倍。1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上發(fā)表文章首次準(zhǔn)確、精煉、客觀的闡述了PCR方法，1976年一種從嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)分離得到的熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶的應(yīng)用大大增加了PCR的效率。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則是源于由Saiki和Mullis等人于1988年發(fā)表在Science上的一篇論文，Mullis當(dāng)時(shí)服務(wù)于Perkin Elmer（PE）公司

3、，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。后來(lái)PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收購(gòu)、分拆、再轉(zhuǎn)賣，而PCR的專利和倍受信賴的PCR儀器生產(chǎn)和銷售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈發(fā)趨向自動(dòng)化，并從中衍生出更多的新技術(shù)方法，可以說(shuō)，PCR技術(shù)是支撐現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展的一塊重要基石。這種技術(shù)的廣泛應(yīng)用催生了一個(gè)龐大的市場(chǎng)，多個(gè)公司均有各種類型的商品化PCR儀出售。PCR的專利目前依然掌握在ABI和Roche（羅氏）兩大公司手中，去年業(yè)界頗為引人矚目ABI訴MJ公司侵犯侵犯PCR儀知識(shí)產(chǎn)權(quán)案最終以MJ敗訴并宣布破產(chǎn)、最終被Bio-rad收購(gòu)暫告一段落。其后還會(huì)不會(huì)

4、有后繼的故事還需拭目以待。 PCR原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成新的單鏈，與模版配對(duì)成為雙鏈分子挎貝。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)與模板DNA的5端結(jié)合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制，多次重復(fù)“變性解鏈退火合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級(jí)數(shù)大量擴(kuò)增特定的基因。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該類酶可以耐受90以

5、上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。從PCR原理可以看出，PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟?，F(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實(shí)驗(yàn)如何在3個(gè)水浴鍋中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進(jìn)，今天的PCR已經(jīng)越來(lái)越完善和智能化。出于市場(chǎng)推廣的戰(zhàn)略需要，各廠家的PCR儀型號(hào)不同，著力宣傳的技術(shù)指標(biāo)和參數(shù)也不盡統(tǒng)一，編者在這里簡(jiǎn)單列出選購(gòu)時(shí)我們認(rèn)為應(yīng)該考慮的常用指標(biāo)，希望有助于大家選購(gòu)PCR儀的選購(gòu)技巧。PCR儀介紹及其選購(gòu)PCR儀的種類總體來(lái)說(shuō)可以分為兩大類：PCR擴(kuò)增儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，普通的PCR擴(kuò)增儀又衍生

6、出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴(kuò)增功能的原位PCR儀等等。1996年由ABI公司首先推出將擴(kuò)增和檢測(cè)融為一體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR儀。一、溫度控制對(duì)普通PCR儀來(lái)說(shuō)，溫度控制指標(biāo)主要是指溫度的準(zhǔn)確性、均勻性、以及升降溫速度，對(duì)梯度PCR儀來(lái)說(shuō)，除了溫度的準(zhǔn)確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。 溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對(duì)于PCR反應(yīng)而言最重要的莫過于溫度控

7、制的準(zhǔn)確性，由于PCR是一個(gè)幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增的過程，擴(kuò)增過程中退火溫度的細(xì)微變化會(huì)被放大而直接影響結(jié)果，不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，對(duì)退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時(shí)1度甚至0.5度的差異也能決定實(shí)驗(yàn)的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對(duì)PCR擴(kuò)增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有時(shí)用同樣的樣品，同樣的PCR反應(yīng)程序，最后的結(jié)果竟然差異非常明顯，或許就是因?yàn)椴煌恢玫臏囟炔痪恍运隆Ｒ恍┦褂眠^早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個(gè)固定的孔，就是因?yàn)檫^往反復(fù)的教

8、訓(xùn)和認(rèn)真的思索得出了這樣的結(jié)論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是最外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果即“位置的邊緣效應(yīng)”會(huì)影響結(jié)果的可重復(fù)性。正是這種位置效應(yīng)對(duì)定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯，所以后來(lái)才有Roche和Cobbett的離心式定量PCR的重大創(chuàng)新。 溫度控制除了精確度，還有一個(gè)廠家喜歡大力宣傳的指標(biāo)升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時(shí)間，能提高PCR反應(yīng)煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對(duì)穩(wěn)定耐用的機(jī)械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導(dǎo)體。除了機(jī)械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導(dǎo)熱性

9、。例如ABI早就有升降溫速度高達(dá)5C的黃金基座(不要誤會(huì)，是銀質(zhì)鍍金而已，要是足金在哪兒可都長(zhǎng)久不了)，最近eppendorf也推出了升降溫速度可達(dá)到6/秒和4.5/秒的銀質(zhì)模塊,是目前同類產(chǎn)品中升降溫速度最快的，據(jù)廠家資料，一個(gè)在其他儀器上原本需要需要4060分鐘的PCR反應(yīng)，eppendorf Mastercycler ep(銀質(zhì)模塊)只需運(yùn)行28分鐘別小看這節(jié)約下來(lái)的幾十分鐘，一天下來(lái)就可以多運(yùn)行好幾輪了。而真正常用而經(jīng)濟(jì)的材料是鋁合金。作為用戶來(lái)說(shuō)，當(dāng)然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的

10、升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因?yàn)闃悠饭芘c基座接觸的緊密性、導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會(huì)影響樣品的實(shí)際升降溫速度?，F(xiàn)在的PCR儀如ABI,Eppendorf的一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應(yīng)管溫控模式）（tube-control）。在模塊溫控模式下，機(jī)器根據(jù)探測(cè)器直接探測(cè)的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺(tái)）的溫度進(jìn)行控制，這種模式適用于長(zhǎng)時(shí)間的靜態(tài)孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。反應(yīng)管溫控模式實(shí)際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探測(cè)器所探測(cè)到的溫控模塊的溫度由計(jì)算機(jī)計(jì)算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來(lái)進(jìn)行控制。一般說(shuō)來(lái)

11、，試管溫控更為準(zhǔn)確，因?yàn)楣軆?nèi)樣品的溫度無(wú)法與溫控模塊同時(shí)達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應(yīng)混合物孵育的時(shí)間與程序設(shè)定的時(shí)間會(huì)有相當(dāng)大的差距。而反應(yīng)管控制精確的算法能自動(dòng)補(bǔ)償時(shí)間，而且適合各種類型的反應(yīng)管，確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時(shí)間維持預(yù)設(shè)溫度。這里要表?yè)P(yáng)的是ABI因?yàn)樗麄兊男麄髻Y料很老實(shí)的指出，模塊升降溫速度高達(dá)3.5，樣品的實(shí)際平均升降溫度是1左右，而且ABI的PCR儀中顯示的溫度也是計(jì)算出來(lái)的樣品溫度而非溫控模塊的溫度。我們看到過有的品牌代理做的宣傳資料中故意引用ABI的“樣品實(shí)際平均升降溫速度”去和自己的模塊升

12、溫速度比較，未免有失公允。有的PCR儀廠家推出了另一種溫控方式；熱敏電極溫控模式。該方法將一個(gè)熱敏電極插入一個(gè)專門的測(cè)量管中（管中裝有礦物油），反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，將該測(cè)量管插入溫控模塊的樣品進(jìn)行檢測(cè)。他們認(rèn)為通過此途徑可以監(jiān)測(cè)反應(yīng)管內(nèi)樣品的實(shí)際溫度，但這種方法未免有些華而不實(shí)；（1）測(cè)量管中礦物油的溫度變化與實(shí)際反應(yīng)樣品的溫度變化未必一致；（2）因?yàn)闇y(cè)量管必須占用一個(gè)樣品孔，所以使用該溫控方式時(shí)就無(wú)法使用96孔PCR板作實(shí)驗(yàn)。梯度PCR 對(duì)于一個(gè)PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算最適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對(duì)于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能P出

13、來(lái)結(jié)果，細(xì)微的變化對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的最佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實(shí)驗(yàn)可在一臺(tái)儀器上完成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。對(duì)于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性

14、和準(zhǔn)確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的最佳條件與標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨(dú)做的結(jié)果出現(xiàn)差異。SteadySlope技術(shù)是eppendorf擁有的梯度PCR技術(shù)專利，可以同樣的溫度變化速率到達(dá)所有設(shè)定的梯度溫度，所以在梯度模式下具有恒定的溫度性。這一技術(shù)保證了在梯度模式和普通模式之間可以進(jìn)行可靠的信息傳遞，不會(huì)因?yàn)闇囟忍匦圆煌鴮?dǎo)致產(chǎn)量和特異性的變化。MJ公司沒有付專利費(fèi)而選擇在梯度模式下采用不同的降溫速率，每個(gè)梯度溫度之間的溫度曲線不同，從梯度模式向普通模式進(jìn)行轉(zhuǎn)換的可能會(huì)出現(xiàn)問題。此外采用TCT（三組回路）技術(shù)的梯度PCR儀由于在梯度PC

15、R模式下增加了一個(gè)加熱和冷卻的控制區(qū)域，保證了梯度溫度控制的精確性并使不同梯度管排間的溫度均勻性更好。在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增，MJ和eppendorf的PCR儀都有提供原位適配器以滿足不同需要。購(gòu)買配有支持原位PCR模塊的PCR儀對(duì)從事醫(yī)學(xué)研究的工作者是很值得的，一機(jī)兩用。此外，隨著基因組高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR儀，各有特長(zhǎng)：MJ有一種一拖四，就是1個(gè)主機(jī)帶4個(gè)擴(kuò)增槽，每個(gè)槽可以獨(dú)立控溫，一次可以作96x4個(gè)樣品的PCR，不過一旦出現(xiàn)問題4個(gè)都不能用了。ABI則在原來(lái)的9700的基礎(chǔ)上推出了雙384孔的基座，一次完成384

16、x2個(gè)樣品，使得9700的功能又?jǐn)U展到高通量領(lǐng)域而無(wú)需購(gòu)買新的機(jī)器，可惜兩個(gè)384槽不能獨(dú)立控溫。eppendorf則有一個(gè)控制面板，可以控制5個(gè)獨(dú)立的PCR儀，每臺(tái)機(jī)器可以聯(lián)合，而且互不影響，但是比較浪費(fèi)空間。二、儀器的功能性和人性化設(shè)計(jì)當(dāng)然是越簡(jiǎn)單方便的設(shè)計(jì)最符合用戶的要求。 熱蓋現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設(shè)為105，使樣品管頂部的溫度達(dá)到105左右，蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會(huì)產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積，這樣用戶就無(wú)需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼反應(yīng)的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因?yàn)閴毫Φ竭_(dá)時(shí)沒有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過

17、松，熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；如果過緊，則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機(jī)械故障。最新的ESP技術(shù)是指熱蓋加熱時(shí)不接觸樣品管，避免加熱樣品管導(dǎo)致非特異產(chǎn)物，等加熱到設(shè)定溫度后熱蓋下降，將樣品管壓入加熱模塊，下降時(shí)間和壓力都由電子控制。樣品基座PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進(jìn)行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個(gè)有趣的設(shè)計(jì)，一個(gè)槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應(yīng)管，或者96孔板，加原位適配器就可以變成原位PCR了。避免了換基座的麻煩。當(dāng)然不同的反應(yīng)管不可以同時(shí)使用的，因?yàn)楦叨炔煌?，熱蓋不能作用。ABI的9700就可以更換不同的樣品槽，樣品槽系列擴(kuò)增到從0.5到標(biāo)準(zhǔn)96孔，到雙384孔板，分別適合不同的需要，相當(dāng)靈活。軟件新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡(jiǎn)易性。大屏幕，顯示實(shí)時(shí)信息，倒計(jì)時(shí)，記憶存儲(chǔ)多個(gè)程序、自動(dòng)斷電保護(hù)等都有助于實(shí)驗(yàn)室中的復(fù)雜環(huán)境使用。程序儲(chǔ)存方面，有人覺得儲(chǔ)存程序的多少似乎意義不太