1、PCR常見問題、原因分析及其對策,主講人：歐陽志荃,PCR技術簡介,PCR常見問題、原因分析及其解決方案,提高PCR反應特異性的策略,主講內(nèi)容,PCR技術簡介,PCR標準反應體系,DNA模板 引物 反應緩沖液 dNTP ddH2O 耐熱聚合酶,反應體系對PCR擴增的影響,DNA模板,純度 蛋白、多糖、酚類等雜質會抑制PCR反應 完整性 模板降解會導致PCR擴增無產(chǎn)物 濃度 加量過多導致非特異性擴增增加 特異性 長度適當、避免二級結構和二聚體 完整性 避免反復凍融 濃度 應適當,過高導致非特異性增加,過低則,引 物,擴增產(chǎn)物太少,反應體系對PCR擴增的影響,反應Buffer,pH值,鹽離子濃度

2、穩(wěn)定劑,增強劑,Mg 2濃度,過高非特異性嚴重 過低無擴增產(chǎn)物,dNTP Mixture,濃度適當 避免反復凍融,ddH2O,pH值適當 避免污染,PCR標準反應體系,DNA模板 引物 反應緩沖液 Mg 2 dNTP ddH2O 耐熱聚合酶,如何選擇最合適的DNA聚合酶,DNA 聚合酶的特性,PCR 實驗的不同需求,如何選擇最合適的DNA聚合酶 DNA 聚合酶的特性,純 度,穩(wěn)定性,酶活性,如何選擇最合適的DNA聚合酶 PCR 實驗的不同需求,長片段擴增,PCR試劑盒,擴增效率,保 真 性,特 異 性,基因組擴增、RT-PCR,基因篩選、測序、 基因克隆,復雜模板擴增（GC含量高、二級結構）,

3、構建基因圖譜、測序、分子遺傳學,復雜模板擴增、大規(guī)?；驒z測,特異性, 熱啟動 Taq酶,原 理,蠟封 抗體抑制 化學修飾,特 點,避免非特異性擴增 提高PCR反應的,特異性,用 途,基因組擴增 RT-PCR, 熱啟動 Taq酶,特異性,保真性, 高保真酶,原 理,用 途,35核酸,表達基因的克隆 基因的定點突變 細胞內(nèi)基因點突變分析（SNP）,外切酶活性 降低堿基錯配率,保真性, 高保真酶,高保真 高擴增效率,原 理,混合酶 高擴增效率 35核酸外切,用 途,超長片段擴增,測序,構建基因圖譜,復雜模板擴增,GC含量高,二級結構,高保真 高擴增效率,PCR MasterMix,原 理,預配好的

4、PCR反應液 DNA聚合酶 反應緩沖液 dNTP PCR增強劑,PCR Master Mix,特 點,快速簡便 減少加樣誤差和污染 靈敏度高 可擴增低至2個拷貝的目的模板 特異性強 降低PCR反應的要求，增強特異性 穩(wěn)定性好 長期放置活性無改變,適用范圍,大規(guī)模基因檢測 目的基因拷貝數(shù)極低的樣本 GC含量高,有二級結構的模板 復雜基因組樣本 可直接檢測菌落，基因點突變檢測, 或者陽性克隆的篩選。,PCR技術簡介,PCR常見問題、原因分析及其解決方案,提高PCR反應特異性的策略,PCR常見問題、原因分析及其解決方案,PCR常見問題,無擴增產(chǎn)物,非特異性擴增,拖尾,假陽性,PCR常見問題之一,無擴

5、增產(chǎn)物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer對樣品不合適 引物設計不當或者發(fā)生降解 反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短,原因,對 策,純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量 更換Buffer或調整濃度 重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結構）或者換一管新引物 降低退火溫度、延長延伸時間,現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；,PCR常見問題之二,非特異性擴增,現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。,PCR常見問題之二,引物特異性差 模板或引物濃度過高 酶量過多 Mg2+濃度偏高 退火溫度偏低 循環(huán)次數(shù)過多,原因,對

6、策,重新設計引物或者使用巢式PCR 適當降低模板或引物濃度 適當減少酶量 降低鎂離子濃度 適當提高退火溫度或使用二階段溫度法 減少循環(huán)次數(shù),非特異性擴增,PCR常見問題之三,拖尾,現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。,M 1 2,PCR常見問題之三,模板不純 Buffer不合適 退火溫度偏低 酶量過多 dNTP、Mg2+濃度偏高 循環(huán)次數(shù)過多,原因,對 策,純化模板 更換Buffer 適當提高退火溫度 適量用酶 適當降低dNTP和鎂離子的濃度 減少循環(huán)次數(shù),拖尾,PCR常見問題之四,假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況),原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染,現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物,對策：

7、 操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外； 除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。 各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。,PCR技術簡介,PCR常見問題、原因分析及其解決方案,提高PCR反應特異性的策略,提高PCR反應特異性的策略,巢式PCR（Nest-PCR）,四種策略,遞減PCR（TouchDown PCR）,熱啟動PCR（HotStart PCR）,使用PCR增強劑,策略之一,巢式PCR（Nest-PCR）,巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互補的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶

8、序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5 RACE）的特異性。,策略之二,遞減PCR（TouchDown PCR）,遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴謹?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設在比估算的Tm高大約5的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2,直到退火溫度低于Tm 5。,特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。,遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。,策略之三,熱啟動PCR （HotStart PCR）,熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達到變性溫度；,現(xiàn)在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應用；,熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。,策略之四,使用PCR增強劑,甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等都可充當PCR的增強劑。,其可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延