1、第二章 酶(enzyme),第一節(jié)酶是生物催化劑,生物體的新陳代謝過程包含許多復(fù)雜而有規(guī)律的物質(zhì)變化和能量變化。綠色植物利用光能將水和CO2、無機(jī)鹽等簡單物質(zhì)，經(jīng)過一系列化學(xué)變化，合成復(fù)雜的糖類、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等。動(dòng)物能將各種食物經(jīng)過復(fù)雜的分解和合成反應(yīng)轉(zhuǎn)化為自身的組成成分和所需的能量，得以生長、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)和繁殖等。新陳代謝是生物其它儀器生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。其中許多反應(yīng)都是在酶的催化下進(jìn)行的。,酶是細(xì)胞所產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。它和一般催化劑比較，具有以下特點(diǎn)。,一、酶的催化特點(diǎn),(1)催化效率高。比非催化高108-1020倍，比其它催化劑高 107-1013倍。,(2)酶的作用具有

2、高度的專一性。一種酶只能催化一個(gè)或一類十分相似的反應(yīng)。通常把酶作用的物質(zhì)叫做底物。,相對(duì)專一性,絕對(duì)專一性: 酶對(duì)底物要求絕對(duì)嚴(yán)格,-葡萄糖苷酶,+H2O,CH 3CH2-O-CO(CH2)14-CH3,若酶只對(duì)順反異構(gòu)體中的一種起催化作用的現(xiàn)象稱為幾何 異構(gòu)專一性。,酶對(duì)底物的專一性如何解釋？,Emil Fisher(德，1984)提出鎖鑰學(xué)說：酶象一把鎖， 酶的底物或底物的一部分猶如鑰匙一樣，能專一性地插 入到酶的活性中心部位而發(fā)生反應(yīng)。,(3)酶容易失活。一般催化劑在一定條件下會(huì)因中毒而失去催化能力。而酶較其他催化劑更加脆弱，更容易失去活性。強(qiáng)酸強(qiáng)堿，高溫等條件都能使酶破壞而完全失去活性

3、。只有在比較溫和的條件下，如常溫、常壓、接近中性的pH條件等起催化作用。,(4)酶活性能受到調(diào)節(jié)控制。調(diào)節(jié)方式多種多樣：共價(jià)修飾、抑制調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素調(diào)節(jié)等。,(5)酶催化活力與輔酶、輔基、金屬離子有關(guān)。若將他們除去，酶就失去活性。,酶催化作用的高效性、專一性以及條件的溫和性使酶在生物體 內(nèi)新陳代謝中發(fā)揮強(qiáng)有力作用，酶活性的可控性是生命活動(dòng)中 各個(gè)反應(yīng)得以有條不紊地進(jìn)行。,二、酶的化學(xué)本質(zhì),根據(jù)酶蛋白的分子特點(diǎn)將酶可分成三類：,1.單體酶：由一條肽鏈組成的酶。,一般都是催化水解的酶，如溶菌酶、胰蛋白酶、核糖核酸酶等。,2.寡聚酶：由兩個(gè)及兩個(gè)以上亞基組成的酶。亞基可以相同，也可以

4、不同。亞基之間是非共價(jià)結(jié)合的、彼此可以分開。例如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脫氫酶等。,3.多酶復(fù)合體：有幾種酶彼此嵌合形成的體系。這類酶催化效率高，容易調(diào)節(jié)，有利于一系列反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。例如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、脂肪酸合成酶復(fù)合體等。,表:含相同亞基的寡聚酶,表:含不同亞基的寡聚酶(P326),三、酶的化學(xué)組成分類,1.單成分酶(單純酶)。僅有氨基酸組成的酶類。,2.結(jié)合酶類(雙成分酶)：由酶蛋白部分和非蛋白兩部分組成。,結(jié)合酶類,決定酶的專一性，即酶催化作用的底物,決定酶催化作用的性質(zhì)，如氧化還原反應(yīng)、基團(tuán)轉(zhuǎn)移、水解、裂解、合成等。,輔助因子,輔基-與酶蛋白結(jié)合較緊密，不易于脫離的輔助因子,輔酶

5、-與酶蛋白結(jié)合松弛，易于脫離的輔助因子,例如NAD+，NADP+，CoASH等。,例如FMN，F(xiàn)AD，血紅素-Fe()等。,結(jié)合酶最大特點(diǎn)是，只有當(dāng)輔助因子與酶蛋白結(jié)合成全酶才具有催化活性。相反，當(dāng)酶蛋白或輔助因子單獨(dú)存在時(shí)不具備催化作用。,總之，輔助因子在酶促反應(yīng)過程中起質(zhì)子、電子、基團(tuán)傳遞者。,四、酶的活性中心概念與特點(diǎn),酶在催化作用過程中，結(jié)合并催化底物發(fā)生變化的局部結(jié)構(gòu)稱為酶的活性中心。,簡單酶的活性中心的化學(xué)本質(zhì)是酶分子中少數(shù)在空間上靠近的、具有特定空間結(jié)構(gòu)的、氨基酸殘基側(cè)鏈構(gòu)成的局部結(jié)構(gòu)。對(duì)于結(jié)合酶(雙成分酶)的活性中心則是由酶蛋白中具有特定空間結(jié)構(gòu)、少數(shù)側(cè)鏈基團(tuán)及輔助因子構(gòu)成的局

6、部結(jié)構(gòu)。,1.酶分子中活性中心必需基團(tuán)：,酶分子中存在的與酶催化活性密切相關(guān)的基團(tuán)稱為酶的必需基團(tuán)。,H+,質(zhì)子與酯分子結(jié)合形成烊鹽，通過增加羰基碳的正電性，削弱了酯鍵，使水分子的氧原子更容易進(jìn)攻而加入。,酶是如何加速化學(xué)反應(yīng)的？,一些酶活性中心中的殘基或基團(tuán),活性中心必需基團(tuán)常見的有His側(cè)鏈的咪唑基、Ser-CH2-OH、Cys-SH，Glu-COO-，Asp-COO-等。,彈性蛋白酶 His42,Asp87,Ser180. 羧肽酶A Arg145,Tyr248,Glu270,Zn2+ 核糖核酸酶 His12,Lys41,His119 溶菌酶 Glu35,Asp52,酶名稱 參與活性中心的

7、殘基或基團(tuán),胰蛋白酶 His42,Asp87,Ser180,-胰凝乳蛋白酶 His57,Asp102,Ser195,Ile16,酶活性中心必需基團(tuán)按照功能分為3類,與底物結(jié)合的基團(tuán),影響底物某些化學(xué)鍵穩(wěn)定性，并催化 底物發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)稱為催化基團(tuán)。,雖不參加酶的催化過程，但確是維持酶活性中心的空間結(jié)構(gòu)所必需的基團(tuán)。,2.酶活性中心的一般特點(diǎn),(1)酶的活性基團(tuán)一般處于酶分子的一個(gè)洞穴或裂縫中，而且是一個(gè)相對(duì)的疏水環(huán)境，其中介電常數(shù)較低，異性電荷之間的作用較強(qiáng)，但仍屬于弱作用力，這有利于酶的催化基團(tuán)對(duì)底物發(fā)揮催化作用。,在生理?xiàng)l件下，它有一半以廣義酸的形式存，另一半以廣義堿的形式存在，即既能提供

8、質(zhì)子，也能接受質(zhì)子。適合酸堿催化的要求。其中的共軛堿形式中1個(gè)N:具有親核催化能力。,a.咪唑基的pK值為6.77.1。,咪唑基是廣義的、十分有效的酸、堿催化基團(tuán)，又是親核催化基團(tuán)(劑)，其原因有兩點(diǎn)：,(3).咪唑基作為催化基團(tuán)常出現(xiàn)在活性中心。,(2)酶的活性中心是一個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)的實(shí)體，底物結(jié)構(gòu)與其誘導(dǎo)匹配性決定酶的專一性。,b.半衰期小于0.1ns(毫微秒),即供出質(zhì)子和接受質(zhì)子的速度幾乎相等，而且十分迅速。,三點(diǎn)附著學(xué)說:A.Ogster在研究甘油激酶催化甘油轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岣视蜁r(shí)提出的。酶具有立體異構(gòu)專一性，是因?yàn)樗饔玫膶?duì)映異構(gòu)體中的底物分子上基團(tuán)空間排布與酶活性中心基團(tuán)相匹配時(shí)，酶才

9、能作用于這個(gè)底物分子。,活性中心必須基團(tuán)在空間排布具有一定的方位，而底物 分子具有構(gòu)型，其中的基團(tuán)在空間的方位只有與活性中心 必須基團(tuán)在空間方位匹配時(shí)，才能結(jié)合。,不匹配,底物與活性部位匹配,誘導(dǎo)契合學(xué)說：Koshland(1958)認(rèn)為，酶分子構(gòu)象是可變的，活性中心結(jié)構(gòu)具有柔性。酶與底物結(jié)合時(shí)，酶分子受底物誘導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生變化，以利于催化基團(tuán)和底物敏感鍵鍥合，形成E-S復(fù)合物。,第二節(jié)酶的命名和分類,1. 氧化還原酶類(oxido-reductases) 2轉(zhuǎn)移酶類(transferases) 3水解酶類(hydr0lases),4裂合酶類(裂解酶類，1yases) 5異構(gòu)酶類(isomer

10、ases) 6. 合成酶類，也稱為連接酶(ligases),酶的系統(tǒng)名稱原則(國際命名方法1961提出)：,“酶作用底物名”:“底物”(或輔助因子)+酶催化性質(zhì)+ “酶”字,乳酸 +NAD+ = 丙酮酸 + NADH + H+,舉例：,丙氨酸:酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.2),丙氨酸+-酮戊二酸=丙酮酸+谷氨酸,谷丙轉(zhuǎn)氨酶,注意水解酶命名方法：“來源”+“底物”+ “酶”字,例如：牛胰RNase(RNAase)，胰蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，唾液淀粉酶等。,乙酰輔酶A:水解酶和乙酰輔酶A:水水解酶說法那個(gè)錯(cuò)？,酶系統(tǒng)命名：,1 氧化還原酶類及系統(tǒng)名 習(xí)慣命名 催化的反應(yīng) 1.1 作用于供體C

11、HOH 基 1.1.1 以NAD+或NADP+為受體 1.1.1.1 醇:NAD+氧化還原酶 醇脫氫酶 醇+NAD+ 醛或酮+NADH 1.1.3 以O(shè)2為受體 1.1.3.4-D葡萄糖:氧氧化還原酶 葡萄糖氧 -D-葡萄糖+O2 酸-內(nèi) 化酶 酯 +H2O2 1.2 作用于醛基或酮基 1.2.1 以NAD+或NADP+為受體 1.2.3 以O(shè)2為受體 1.2.3.2 黃嘌呤:氧氧化還原酶 黃嘌呤氧 黃嘌呤+O2 尿酸+H2O2 化酶,“底物1:底物2”+催化反應(yīng)性質(zhì)+”酶”字,1、氧化還原酶類: 顧名思義是催化氧化還原反應(yīng)的酶。反應(yīng)通式： AH2 + B = A + BH2 如乙醇脫氫酶、3

12、-磷酸甘油醛脫氫酶等。,二、六大類酶的特征,脫氫酶類的輔酶是NAD+或NADP+，F(xiàn)AD或FMN。有些酶可用NAD+也可用NADP+，如L-谷氨酸脫氫酶，蘋果酸脫氫酶催化蘋果酸脫氫的反應(yīng)。,3、水解酶類催化底物的加水分解或其逆反應(yīng). 如胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、核酸酶等。該類酶包括9個(gè) 亞類，每一亞類表示被水解鍵的性質(zhì)，如：,2、轉(zhuǎn)移酶類:催化某一化合物上的某一基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物上。,如轉(zhuǎn)甲基酶、轉(zhuǎn)氨酶等。轉(zhuǎn)移酶類包括8個(gè)亞類，每一亞類表示被轉(zhuǎn)移基團(tuán)的性質(zhì)。如：,谷丙轉(zhuǎn) 氨酶,3.1 水解酯鍵; 3.2 水解糖苷鍵; 3.3 水解肽鍵;,4、裂合酶類(裂解酶類)催化底物的裂解或其逆反應(yīng)。

13、底物裂解時(shí)，一分為二；產(chǎn)物中往往留下雙鍵。在逆反應(yīng) 中，催化某一基團(tuán)加到這個(gè)雙鍵上。,如醛縮酶催化l，6-二磷酸果糖分子斷裂生成磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛的反應(yīng)。,6、合成酶類,5、異構(gòu)酶類催化同分異構(gòu)體之間的相互轉(zhuǎn)變。 如磷酸丙糖異構(gòu)酶催化3-磷酸甘油醛和磷酸二經(jīng)丙酮之間的相互轉(zhuǎn)變。該類酶包括6個(gè)亞類，亞類表示異構(gòu)作用的類型.,磷酸丙糖異構(gòu)酶,A + B + ATP A-B + ADP + Pi,催化由兩種或兩種以上的物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)，且必須有 ATP參加。反應(yīng)通式：,如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化為草酰乙酸的反應(yīng)。,判斷下列說法正確與否：,1.催化ATP+葡萄糖 6-磷酸葡萄糖+AD

14、P的酶屬于磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶。( ),2.蛋白質(zhì)激酶屬于合成酶。 ( ),3.醛縮酶屬于裂合酶，所以系統(tǒng)名編號(hào)應(yīng)該為EC4.X.X.X。 ( ),催化蛋白質(zhì)磷酸化的酶。,第三節(jié) 酶的活力測定與計(jì)算,酶的活力就是酶加速其所催化的化學(xué)反應(yīng)速度的能力。測定酶的活力就是測定酶促反應(yīng)進(jìn)行的速度。酶促反應(yīng)速度越大酶的活力越強(qiáng)。酶的多少不能用重量單位或濃度單位來表示。因?yàn)槊覆灰字瞥杉兤?，特別是工業(yè)用的一些酶制劑常常含有很多雜質(zhì)。所以，不能像化學(xué)純品那樣直接用重量或體積來表示它的多少。故酶的含量常常用酶的活力表示。,一、酶活力、活力單位和測定條件,酶的活力大小可以用在一定條件下它所催化的反應(yīng)速度來表示。酶促反應(yīng)速

15、度則用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增量表示。,國際單位：在最適條件下(25C)，每分鐘內(nèi)催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個(gè)酶活力單位(IU)。(1961年),實(shí)際應(yīng)用IU常常很繁瑣，人們往往采用習(xí)慣活力單位。,蛋白酶活力單位習(xí)慣定義：1個(gè)1min內(nèi)將底物酪蛋白分解產(chǎn)生1g酪氨酸的酶量。,淀粉酶活力單位習(xí)慣定義：1小時(shí)內(nèi)水解1g淀粉的酶量。有的部門則采取每小時(shí)分解1ml2%的淀粉溶液的酶量為1個(gè)活力單位。,1972年國際酶學(xué)委員會(huì)由推薦一種新的酶活力單位Katal(簡寫Kat)。1Kat為每秒鐘內(nèi)能使1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。若每秒鐘內(nèi)使1mol底物轉(zhuǎn)化的酶量則為1Kat。,1K

16、at=60106IU,1IU = 1/60 Kat =16.67nKat,(nKat:纖Kat),酶活力測定條件：最適溫度、最適pH、最適底物濃度和最適緩沖溶液的離子強(qiáng)度。,國際單位：在最適條件下(25C)，每分鐘內(nèi)催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個(gè)酶活力單位(IU)。(1961年),計(jì)算舉例：現(xiàn)有1g淀粉酶制劑（干粉末），用蒸餾水溶解并定溶至1000ml，從中吸取0.5ml測定該酶活性，測定得知 5min分解0.25g淀粉。計(jì)算每g酶制劑（干粉末）所含的淀粉 酶活力單位數(shù)；經(jīng)測定酶液蛋白氮為0.04mg/ml,計(jì)算淀粉酶 比活力為多少？（淀粉酶活力單位規(guī)定為：在最適條件下，每小時(shí)分解1g

17、淀粉的酶量為1個(gè)活力單位）。,酶活力/克酶制劑=,=6000(u),酶比活力=,=24,解題：,二、比活力,活力單位/毫克蛋白質(zhì)(U/mg蛋白質(zhì))。,比活力用來表示每單位重量酶蛋白的催化能力。對(duì)于同一種酶來說，比活力越高，表明酶越純。,表示方法：,三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(Kcat),酶的轉(zhuǎn)換數(shù)為每秒鐘每摩爾酶分子轉(zhuǎn)換底物的摩爾數(shù)(mol)。,指每mg酶蛋白所具有的酶活力。,Kcat意義：Kcat相當(dāng)于一旦底物-酶(ES)中間絡(luò)合物形成后，酶將底物轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的效率。,Kcat量值： Kcat=K3，K3表示米氏方程導(dǎo)出部分中的K3，是由ES形成產(chǎn)物的速度常數(shù)，而且是只有當(dāng)所有的活性中心都被底物飽和時(shí)才有

18、意義。,Kcat=,=K3,酶比活力=,=560單位mg蛋白-1,酶的轉(zhuǎn)換數(shù)是指每摩爾的酶(單體酶)或酶活性部位的摩爾數(shù)(含多個(gè)活性部位的酶)在單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化底物的摩爾數(shù)。,每個(gè)活性部位的轉(zhuǎn)換數(shù),=5600min-1,練習(xí)1(自完成):,碳酸酐酶催化H2O+CO2=H2CO3，碳酸酐酶的相對(duì)分子量為30000。如果10g純的碳酸酐酶于37C及最適條件下，1min內(nèi)催化0.30g的CO2水合，計(jì)算該酶的轉(zhuǎn)換數(shù)。(2.010-7min-1),四、酶反應(yīng)速度概念,酶的反應(yīng)速度用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物的減少量來表示。酶速度單位：底物變化量/單位時(shí)間。,斜率=濃度/時(shí)間=v,圖t1時(shí)間之內(nèi)，酶促反應(yīng)速

19、度保持恒定。隨時(shí)間延長，酶促反應(yīng)速度下降。,因此，測定酶促反應(yīng)速度應(yīng)該以初速度為準(zhǔn)。,為了檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測定反應(yīng)系統(tǒng)是否正常，通常在測定時(shí)應(yīng)該先制作兩種曲線(直線)。(1)酶反應(yīng)進(jìn)程曲線，進(jìn)而確定每反應(yīng)初速度(如上圖)。(2)根據(jù)酶反應(yīng)初速度制作酶濃度曲線,其原因主要有：反應(yīng)體系底物濃度下降，酶在一定pH及溫度下部分失活，產(chǎn)物濃度增加對(duì)酶產(chǎn)生抑制及加速了逆反應(yīng)速度等。,H+,第四節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),主要研究酶反應(yīng)速度規(guī)律以及各種因素對(duì)與酶反應(yīng)速度的影響。,一、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,反應(yīng)體系E濃度保持恒定，增加S，測定底物變化量，得如下曲線。1902年 Brown首先提出中間復(fù)合物學(xué)說。,V

20、m,中間復(fù)合物學(xué)說：,E + S E-S E + P,E表示游離酶,S表示游離底物,E-S表示酶-底物絡(luò)合物,P酶作用的產(chǎn)物,產(chǎn)物P的生成速度代表整個(gè)酶催化的反應(yīng)速度。而產(chǎn)物的生成速度取決于ES。因此整個(gè)酶反應(yīng)的速度取決于ES大小。,曲線特征：,S很小(低)時(shí)，酶促反應(yīng)速度與S成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。,S再增大， V不再按正比升高。表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)。,S增大到一定程度， V不會(huì)隨S增大而增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。并接近最大反應(yīng)。,E + S E-S E + P,當(dāng)?shù)孜餄舛缺容^高時(shí)，溶液中的酶全部與底物結(jié)合成中間絡(luò)合物，沒有游離的E。增加底物濃度也不會(huì)有更多的中間絡(luò)合物形成，此時(shí)底物濃度與反應(yīng)速度幾

21、乎沒有關(guān)系。反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度。,二、米氏方程的導(dǎo)出,E + S E-S E + P,1913年Leonor Michaeli & Maud Menten建立了十分簡單的動(dòng)力學(xué)方程比較準(zhǔn)確地反映了酶促動(dòng)力學(xué)原理。1925年Briggs & Haldane對(duì)米氏方程作了修正。,酶促反應(yīng)分步進(jìn)行，第一步是E與S結(jié)合生成酶-底物絡(luò)合物(ES)，經(jīng)催化生成產(chǎn)物P并脫離酶。,產(chǎn)物P的生成速度代表整個(gè)酶催化的反應(yīng)速度。而產(chǎn)物的生成速度取決于ES。因此整個(gè)酶反應(yīng)的速度就取決于ES。,ES的形成量不僅與E+S有關(guān)，而且與P+E有關(guān)。當(dāng)S很低酶反應(yīng)處于初速度階段，P的量更少，P+E生成ES的速度極小，可以忽略

22、不計(jì)。,ES的形成速度=K1ES,ES的分解速度=(K2+K3)ES,V=K3ES,當(dāng)整個(gè)酶反應(yīng)體系處于動(dòng)態(tài)平衡，即ES的生成速度等于分解速度，此時(shí)有：,K1ES = (K2+K3)ES,(1),(2),令：,并代入上式，可得：,E代表的是未與底物結(jié)合的游離酶濃度，即：,E=EtES,(3),代入上式(3)，可得：,(4),整理(4)式，得：,ES=,因?yàn)椋?V=K3ES,所以：,V=K3ES,(引入米氏常數(shù)),V=K3ES,當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到很高時(shí)，所有酶都被S結(jié)合成ES，即,Et=ES,此時(shí)，酶促反應(yīng)達(dá)到了最大反應(yīng)速度：,Vm= K3ES = K3Et,代入上式，可得：,V=,上式則為修正后的

23、米氏方程。,(一)米氏方程討論：,=Vm=K3ES,零級(jí)反應(yīng),1.當(dāng)S很低時(shí)，即 S Km, 但 S E ，這時(shí) V S，即為一級(jí)反應(yīng)；,2.當(dāng)S很高時(shí)，即 S Km， Km 可忽略不計(jì)：,一級(jí)反應(yīng),3.令V =1/2 Vm，并代入米氏方程,得：,即：2S=Km + S ,Km= S ,Km 含義： 就是當(dāng)酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位：mol/L或mmol/L。,當(dāng)某種酶能催化2種底物變化時(shí)，對(duì)于S1達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)需要的S1和催化S2達(dá)到最大反應(yīng)速度一半需要S2誰大、誰?。?S1,S2,酶對(duì)作用底物的Km 越小，表明酶對(duì)該種底物的親和力越大。相反，酶對(duì)所作用底物的

24、Km越大，親和力就越小。因此，Km大小是酶對(duì)特定底物親和力大小的度量的尺度。,(二)米氏常數(shù)的意義,1.Km值是酶的一個(gè)基本特征性常數(shù),對(duì)于特定的反應(yīng)來說Km是酶的特征性常數(shù)。它的大小與酶的性質(zhì)有關(guān)，和酶的濃度無關(guān)。而與具體的底物有關(guān)，并且隨溫度pH和離子強(qiáng)度的改變而改變。不同酶對(duì)底物的Km值不同，通過 Km值，可以鑒別酶。,2.從Km值可以判斷酶的專一性和天然底物,一些專一性差的酶往往可作用幾種底物，并對(duì)應(yīng)幾個(gè)Km值。其中Km最小的，通常就是該酶的天然底物。,溶菌酶 N-乙酰氨基葡萄糖 610-6 -半乳糖苷酶 乳糖 4 10-3 碳酸酐酶 CO2 810-3 蘇氨酸脫氨酶 蘇氨酸 510-

25、3 丙酮酸羧化酶 丙酮酸 4 10-4 HCO3- 1 10-3 精氨酸-tRNA合成酶 精氨酸 3 10-6 tRNA 4 10-7 ATP 3 10-4,3.從Km的大小可以知道正確測定酶活性時(shí)所需底物濃度。,例題：計(jì)算當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)的99%時(shí)，底物濃度應(yīng)改為多大？,解：,99%Vm=,S=99Km,4.Km值可以判斷某一代謝物在體內(nèi)可能的代謝途徑。,當(dāng)丙酮酸濃度比較低時(shí)，此時(shí)丙酮酸循那條代謝路經(jīng)而變化？,答：循酶對(duì)底物親和力最大的途徑代謝。即Km最小的途徑代謝。,Km、 Vm的確定，主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算。,用v =1/2Vm, Km= S 的方法求KmVm值有幾個(gè)問題需要注意：,

26、雙倒數(shù)作圖法,（三）、米氏常數(shù)的求解, Vm 測不準(zhǔn)； 高底物濃度時(shí)所生成的大量產(chǎn)物是否對(duì)反應(yīng)有抑制作用； 高底物濃度是否能溶解。,此方法簡便，應(yīng)用最多，但實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過分集中在直線左端，作圖不易準(zhǔn)確。,第五節(jié)影響酶作用的因素,一、溫度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,1、酶促反應(yīng)和一般反應(yīng)一樣，溫度升高，反應(yīng)物的能量增加，因而反應(yīng)速度加快；,2、隨溫度繼續(xù)升高，酶分子吸收了過多的能量使維持酶分子空間構(gòu)象的次級(jí)鍵斷裂，導(dǎo)致熱變性，因而反應(yīng)速度迅速下降。,大多數(shù)酶最適溫度在3045C左右，在60C以上則趣于變性。少數(shù)酶能耐高溫。如細(xì)菌淀粉酶在93C時(shí)活力最高，牛胰核糖核酸酶加熱到100C仍不失活。,二、pH對(duì)酶反應(yīng)

27、速度的影響,大多數(shù)酶在某一pH時(shí)的反應(yīng)速度達(dá)到最高值，低于或高于此pH值時(shí)反應(yīng)速度有所降低，這個(gè)pH叫作酶的最適pH值。pH和酶的反應(yīng)速度關(guān)系曲線一般呈鐘形。,酶 最適pH 胃蛋白酶 1.5 木瓜蛋白酶 4 10 胰蛋白酶 2.5(30C24小時(shí)) 胰蛋白酶 110(0C反應(yīng)15分) 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 37.5活性幾乎不變,最適pH值,1.pH對(duì)酶分子本身穩(wěn)定性有 影 響；過酸或過堿，酶變性失活。 2.pH對(duì)酶分子活性中心外必需基團(tuán)解離程度的影響； 3.pH對(duì)底物分子解離狀況的影響；最適pH時(shí)酶活性中心必需 基團(tuán)解離狀態(tài)和底物解離狀態(tài)最有利于兩者的作用，故酶 的活性最高。,4.酶在體外反應(yīng)的pH與它

28、所在正常細(xì)胞的生理pH不一定完全相同。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)可能會(huì)有幾百種酶，可能一些酶的最適pH是細(xì)胞的生理pH，而另一些酶則不是。不同酶表現(xiàn)出不同活性。這種差異對(duì)于控制細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝途徑可能具有很重要的意義。,三、激活劑對(duì)酶活性的影響,凡是能夠提高酶活力的化合物稱為酶的激活劑。,激活劑 按其分子量大小可分為以下三種:,無機(jī)離子激活機(jī)理,1.無機(jī)離子激活劑如Cl-、Br-、某些金屬離子、Na+ 、K+ 、 Mg2+ 、Ca2+ 、Zn2+ ，Mn2+等。,活性中心必需成分；,-淀粉酶：Na+ ，K+，Ca2+(穩(wěn)定酶的活性構(gòu)象),穩(wěn)定酶的活性構(gòu)象；,在活性中心與底物之間起橋梁作。,例如：,合成酶：Mg

29、2+，Ca2+(酶與底物之間的橋梁),羧肽酶：Zn2+ (活性中心必要組分),唾液淀粉酶：Cl-(維持酶的活性構(gòu)象),2.一些小分子的有機(jī)化合物,酶 激活劑 巰基酶 Cys、GSH 脂肪酶 牛黃膽酸鈉 蛋白激酶 cAMP,Mg2+ 磷酸果糖激酶 ATP,3.生物大分子激活劑,一些蛋白激酶對(duì)某些酶共價(jià)磷酸化修飾而激活，在生物體代 謝活動(dòng)中起重要的作用。,4.酶原與酶原激活系統(tǒng),胰蛋白酶原激活,酶原與酶原激活的概念：,生物機(jī)體中的部分酶（如消化系統(tǒng)的酶類）在剛合成出來時(shí)不具有催化活性，即屬于一種無活性的酶的前體，它的活性中心被掩埋在分子的內(nèi)部或尚未形成，需要經(jīng)過一定的剪切，使其肽鏈重新盤繞，活性中

30、心方能暴露或形成。這類無活性酶的前體稱為酶原(zymogen或proenzyme)。,由酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚悦傅倪^程稱為酶原激活。,例如：,胰蛋白酶原,胰腺合成分泌,進(jìn)入小腸消化蛋白,胰蛋白酶原（無活性）,胰蛋白酶（有活性）,腸激酶Ca2+,223肽,229肽,特點(diǎn)及意義：酶原激活是生物的一種調(diào)控機(jī)制。激活酶原的酶具有組織特異性，因此，酶原只有被運(yùn)送到一定的組織后才能受相應(yīng)的酶作用而被激活。這種方式有利于調(diào)節(jié)和對(duì)組織起保護(hù)作用。消化類、血液凝固系統(tǒng)等的酶多屬此類酶。,又如：,1不可逆的抑制作用 特點(diǎn)：EI共價(jià)結(jié)合，E失活，不可逆。,四、抑制劑(inhibitor I)的抑制作用,凡是能與酶分子上的

31、某些基團(tuán)，主要是活性中心的一些基團(tuán) 結(jié)合，使酶活性中心的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，從而引起酶活 力下降或喪失的物質(zhì)，稱為抑制劑。,(1)重金屬離子、有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物如Pb2+、Hg2+及 含有Hg2+ 、Ag+ 、As2+離于的化合物可與某些酶活性 中 心的必需基團(tuán)如巰基結(jié)合而使酶失去活性?；瘜W(xué)毒劑 “路易士氣”就是一種含砷的化合物，它能抑制需巰 基 的酶的活性。,(2)有機(jī)磷化合物 如有機(jī)磷農(nóng)藥，敵敵畏，敵百蟲等，能 與酶(如乙酰膽堿酯酶)活性中心上的絲氨酸以共價(jià)鍵結(jié)合而 使酶喪失活性。抑制劑對(duì)膽堿酯酶抑制作用。,+HOCH2CH2N+(CH3)3,乙酰膽堿不能及時(shí)地分解掉，造成突觸間隙乙酰膽

32、堿的積蓄， 進(jìn)而使神經(jīng)持續(xù)過度興奮。此時(shí)引起抽搐，最終導(dǎo)致死亡。 因此，有機(jī)磷類物質(zhì)又稱為神經(jīng)毒劑。,(3)氰化物和一氧化碳 這些物質(zhì)能與金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，而使一些需要 金屬離子的酶活性受到抑制。如含鐵卟啉輔基的細(xì)胞色素 氧化酶。,2可逆的抑制作用,抑制劑與酶以非共價(jià)鍵方式結(jié)合而引起酶的活性降低或喪 失，用透析超濾等方法可除去抑制劑而使酶恢復(fù)活性，此 種抑制作用稱為可逆的抑制作(reversible inhibition)。主要有 下列三種。,(1)競爭性抑制作用(competitive inhibition),特點(diǎn)：I與S結(jié)構(gòu)相似，兩者競爭E的活性中心。E-I不能再結(jié)合S，同樣E-S

33、不能再結(jié)合I。,I抑制程度與I/S有關(guān)；,增加S可消除I的抑制用。,(2)非競爭性抑制作用(nocompetitive inhibition),E + S ES E + P,I,三元復(fù)合物中的底物不會(huì)變?yōu)楫a(chǎn)物。相當(dāng)于該系統(tǒng)E有效濃 度減小，整個(gè)體系酶催化反應(yīng)速度降低。,特點(diǎn)：I與S結(jié)構(gòu)毫無相似之處，I結(jié)合部位與底物不同；,I抑制程度僅僅與I及I與酶的親和力大小有關(guān)；,增加S不能消除I的抑制作用。,E + S ES E + P,(3)反競爭性抑制作用(uncompctitive inhibition),三元復(fù)合物中的酶 不能促使底物變化， 相當(dāng)于酶的有效濃度 減小，體系酶催化反 應(yīng)速度降低。,I

34、 ESI 無產(chǎn)物生成,競爭性抑制：當(dāng)抑制劑濃度增加時(shí)，Km減小，隨底物濃度增加又會(huì)逐漸恢復(fù)；非競爭性抑制：抑制劑濃度增加，Km不變，隨底物濃度增加，結(jié)合抑制劑的酶不會(huì)復(fù)原。,當(dāng)體系存在反竟?fàn)幮砸种苿r(shí), Km減小,Vm 也減小，斜率不變。,Km,Vm,斜率,增大 不變 減小,不變 減小 減小,增大 增大 不變,*以雙倒作圖法的變化為基礎(chǔ)進(jìn)行的討論。,第六節(jié) 酶催化作用機(jī)制,實(shí)質(zhì)：酶能降低反應(yīng)的活化能。,化學(xué)變化的實(shí)質(zhì)就是舊鍵斷裂，新鍵形成。催化劑的作用實(shí) 質(zhì)是什么？,換言之：削弱底物反應(yīng)部位的敏感鍵，使其更容易斷裂，進(jìn)而形成新的化學(xué)鍵。,酶與底物作用時(shí)通過那些方式削弱化學(xué)鍵的？,誘導(dǎo)契合學(xué)說

35、鄰近與定向效應(yīng) 酸堿催化 共價(jià)催化 微環(huán)境的影響。,誘導(dǎo)契合學(xué)說,E-S,E活性中心與S結(jié)構(gòu)不完全吻合,底物變產(chǎn)物E恢復(fù)原狀,D.E.Koshland,1958提出，后通過羧肽酶等進(jìn)行X光晶體衍射結(jié)果得以證實(shí)。,2.鄰近與定向效應(yīng),底物分子與酶分子相比較要小的多，酶的活性中心是酶與底物的作用部位。酶的活性中心常常處于酶分子中的一個(gè)洞穴內(nèi)。底物分子進(jìn)入并能濃集于其中，這種現(xiàn)象稱為“鄰近”效應(yīng)?；钚灾行牡牡孜餄舛纫话闶窃撊芤褐械?05倍。,例如碳酸酐酶催化的反應(yīng)為： CO2 + H2O = HCO2- +H+ 該酶為單體酶，含有260個(gè)氨基酸殘基。該酶的活性心含Zn2+，并與酶活性中心的三個(gè)組氨酸

36、(His94，His96，His119)側(cè)鏈上的嘧唑基的N原子配位，而第四個(gè)配位體是H2O或羥基(Thr109)。,酸堿催化,溶菌酶的催化作用機(jī)理,4.共價(jià)催化,H-S-CH2-E,例如3-磷酸甘油醛脫氫酶的催化過程就 是共價(jià)催化作用：,-2H,又稱為親核催化(nucleophilic catalasis)或親電子催化 (electrophilic catalysis)是具有非共用電子對(duì)的原子或基團(tuán)，攻擊缺少電子或具有部分正電性的原子從而形成一種不穩(wěn)定的共價(jià)中間復(fù)合物，降低反應(yīng)活化能，使反應(yīng)加速。,微環(huán)境的影響,第七節(jié) 幾種重要的酶概念,一、抗體酶(abzyme),具有催化作用的一類免疫球蛋白

37、。,利用穩(wěn)定的底物過度態(tài)類似物作抗原，對(duì)進(jìn)行免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫球蛋白。,研究意義：,1.過度態(tài)類似物提供了探索催化機(jī)制模型； 2.它們能作為酶的特別強(qiáng)的抑制劑； 3.它們能作為抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的新酶。,二、變構(gòu)酶,機(jī)體內(nèi)的酶有三種方式調(diào)節(jié)活性：變構(gòu)調(diào)節(jié)；可逆的共價(jià)修飾；酶原激活。,(a11osteric enzyme),1.變構(gòu)酶的概念、特點(diǎn)和性質(zhì),由于受小分子效應(yīng)物結(jié)合，構(gòu)像變化，活性明顯得以調(diào)節(jié)的一類酶，稱為變構(gòu)酶。,變構(gòu)酶特點(diǎn)：,活性中心結(jié)合底物并催化底物變化；,調(diào)節(jié)中心結(jié)合效應(yīng)物或調(diào)節(jié)物，能引起亞基構(gòu)象變化，進(jìn)而影響催化亞基對(duì)底物的親和力和摧話活性。,(2)酶分子具有底物結(jié)合的活性中心

38、，也有與調(diào)節(jié)物結(jié)合的別構(gòu)中心，這兩中心可位于同亞基不同部位，也可在不同亞基上；,(3)變構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)曲線不服從米氏方程式。它的v-s關(guān)系曲線呈S型。別構(gòu)酶具有S型曲線的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，對(duì)于較小的底物濃度的變化，酶反應(yīng)速度即可作出靈敏的應(yīng)答。,(1)多亞基，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)；,一個(gè)效應(yīng)物分子與變構(gòu)酶的調(diào)節(jié)中心結(jié)合后，對(duì)酶分子催化底物變化能力的影響稱為協(xié)同效應(yīng)(cooperativeeffect)。當(dāng)?shù)孜锉旧碜饔眯?yīng)物，結(jié)合到調(diào)解中心后對(duì)酶活性的影響稱為同促效應(yīng)；如果效應(yīng)物是底物以外的其它物質(zhì)，當(dāng)結(jié)合到調(diào)節(jié)中心，對(duì)酶活性產(chǎn)生的影響稱為異促效應(yīng)。,多數(shù)別構(gòu)酶既能受底物的調(diào)節(jié)，也能受底物以外的效應(yīng)物的調(diào)節(jié)，即

39、兼具同促和異促效應(yīng)。當(dāng)酶結(jié)合效應(yīng)物后，由于構(gòu)象發(fā)生改變，使得催化活性增高，這些別構(gòu)酶稱為正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶。相反則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶。所產(chǎn)生的效應(yīng)分別稱為正協(xié)同效應(yīng)和負(fù)協(xié)同效應(yīng)。,2.變構(gòu)酶動(dòng)力學(xué),Koshland等人建議定量區(qū)別米氏酶、正協(xié)同效應(yīng)酶、負(fù)協(xié)同效應(yīng)酶標(biāo)準(zhǔn)：,米氏酶,正協(xié)同效應(yīng)酶,負(fù)協(xié)同效應(yīng)酶,序變模型(也稱KNF模型，),一配體(效應(yīng)物)結(jié)合到一亞基上，該亞基構(gòu)象從T(方的)變成R(圓的)狀態(tài)，這種轉(zhuǎn)變會(huì)增加其余亞基對(duì)配體的親和力，這叫序變模型。,1.對(duì)于任何亞基可以進(jìn)入的構(gòu)象有兩種：T和R狀態(tài)； 2.配基(效應(yīng)物)連接到特別的亞基上，誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)變亞基構(gòu)象； 3.在一個(gè)亞基中底物的結(jié)合引起構(gòu)象變化，可增加或減少其余亞基對(duì)底物的結(jié)合力。,3.變構(gòu)酶作用機(jī)理,齊變模型(也稱MWC模型),要點(diǎn)：1.蛋白質(zhì)兩種構(gòu)象T和R相互轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)變具有同時(shí)性，即蛋白質(zhì)分子中的亞基要么全TT，要么全RR，沒有中間雜交TR態(tài)。2.不利于配基的連接狀態(tài)是T。全部松散有利于配基結(jié)合的是R狀態(tài)；3.每一配基(或底物)的連接增加可能性：分子中亞基都成為R狀態(tài)。即亞基變構(gòu)是齊步進(jìn)行的。,血紅蛋白分子氧合過程變構(gòu)行為更多通過其變模型。,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，簡稱ATCase。