1、第十章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定第一節(jié) 概述,1. 蛋白質(zhì)概況 蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。,食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測(cè)定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測(cè)）。 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%13%總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量

2、及類型不同。 蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。,蛋白質(zhì)的測(cè)定方法分兩大類： 一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量； 另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。,具體測(cè)定方法： 凱氏定氮法最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。 雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法 國外： 紅外分析儀,氨基酸總量酸堿滴定法測(cè)定。 各種氨基酸的分離與定量色譜技術(shù)。 有多種氨基酸分析儀。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定性測(cè)定,一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng) 電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書中列舉了 5 種染料。 二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反

3、應(yīng) （一）糖蛋白的顯色（3種方法） （二）脂蛋白的顯色（2種方法）,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定,一般說來，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為 20.0%左右，豬肉 9.5%， 兔肉 21%， 雞肉 20%， 牛乳 3.5%， 帶魚 18.0%， 大豆 40%， 面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黃瓜 1.0%， 蘋果 1.4% 測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。,一些蛋白質(zhì)的含氮量 一般為 15% 17.6%，有的上下浮動(dòng)可以測(cè)出總氮 N,一、凱氏定氮法

4、由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。書中只介紹前三種。,= N6.25 = 蛋白質(zhì)含量,（一）常量凱氏定氮法,1. 原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。 用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。 也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。,整個(gè)過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定,1. 消化 總反應(yīng)式：,加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)， 純

5、硫酸沸點(diǎn) 340，加入硫酸鉀之后可以提高 至400以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提 高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。, 加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做蒸餾時(shí)堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。, 加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī) 物氧化速度。,儀器：219頁 要防止爆沸。 另外：介紹“自動(dòng)回流消化儀”,2. 蒸餾 消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。,3. 吸收與滴定 用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑）國標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。 指示劑 紅色 綠色 紅色 （酸） （堿） （酸） 用過量的

6、 H2SO4 或 HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。,吸收,滴定,操作方法：158頁，其中講“以奈氏試 劑”檢查氨是否全部蒸完，,以奈氏試劑Nessler試劑，K2（HgI4） 檢驗(yàn)NH4+離子，遇銨根，離子析 出黃色或紅棕色沉淀。 配制 方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時(shí)過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。,方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于適量少許水，后加水稀釋至50 ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲(chǔ)存于棕色瓶中。,結(jié)果計(jì)算：1

7、58頁 注意：F氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為 6.25 也可查表。 說明： 所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。 消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。, 消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。, 樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。, 若取樣量

8、較大，如干試樣超過5 g 可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。, 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。, 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在7090時(shí)發(fā)黑。, 蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。,二、微量凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、與常量法不同點(diǎn)： 加入硼酸量有50 ml 10

9、 ml, 滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸餾裝置見 159 頁圖 10-2 。,10-2,10-2,三、自動(dòng)凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、特點(diǎn)： （1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。 （3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。,二、雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染。 新開發(fā)的：雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結(jié)合法、 水楊酸比色法

10、等。,1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。,雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)） 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測(cè)其吸光度，確定含量。（560nm）,NH2CONHCONH2 + NH3,注：測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化,2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。 3.主

11、要儀器： 分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000 r/min） 4. 試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液 (2) 四氯化碳,5操作方法：采用凱氏法測(cè)出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。 三紫外吸收法 1原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，,對(duì)紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。,2適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。 3主要儀器： 紫外分光光度計(jì) 離心機(jī)（3000 5000 r/min） 4操作：用凱氏法測(cè)定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線,第五節(jié) 氨基酸的定性測(cè)定,利用各種顯色反應(yīng)（170174頁）。,第六節(jié) 氨基酸定量測(cè)定一氨基酸的一般定量測(cè)定（一）甲醛滴

12、定法,1.原理：氨基酸本身有堿性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛 溶液后，與 NH2 結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定 COOH 基。 2特點(diǎn)：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測(cè)定）,3雙指示劑： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用 氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性紅50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。 4操作：同時(shí)取兩份樣： + 中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和 樣液中其它酸性物質(zhì)。 + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 樣液中

13、氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總 和。 二者之差可計(jì)算氨基酸含量,（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，可比色定量。 二個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定 介紹了8種氨基酸的定量測(cè)定方法。,第七節(jié) 氨基酸的分離與測(cè)定 一薄層色譜法（薄層層析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 簡(jiǎn)介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留

14、量、黃曲霉毒素等。,（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。,Rf = a / b,a,b,樣點(diǎn),溶劑前沿,點(diǎn)樣原點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 展開時(shí)間短，一般在2030分鐘，展開距離通常只需10 cm，且分離效果好。 層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。 點(diǎn)樣量少，靈敏度高。（比紙層析高10100倍） 精

15、確到0.01ug。 也可用于大量分離500 mg，作為樣品制備層析。 缺點(diǎn)：Rf值重現(xiàn)性比紙上層析差。 分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。,（三）操作方法： 薄層板制備 樣品液制備 點(diǎn)樣：距薄板底端2cm處，用針畫一標(biāo)記作為 原點(diǎn)。再以點(diǎn)樣距扳子寬窄可點(diǎn)幾個(gè)點(diǎn)同時(shí) 展開，點(diǎn)與點(diǎn)之間間隔12cm。 a.可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一個(gè)點(diǎn)干了再點(diǎn)另一個(gè)點(diǎn)。 b.用一小直徑3 mm 濾紙片，浸入樣液，埋到 板子上先挖好一個(gè)小洞穴。, 展開：點(diǎn)樣完了，放入密閉容器中（展開槽），傾斜一定角度1030，下端浸入展開劑1cm，千萬別讓溶劑浸過了樣點(diǎn)。到離頂端一部分，

16、取出樣板、晾干、顯色。,a.展開劑的有關(guān)情況：主要是低沸點(diǎn)的23種有機(jī)溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展開劑的選擇，因?yàn)槲絼┰谝欢ㄇ闆r下是恒定的，吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇。,b.展開劑的選擇方法： .微量圓環(huán)法。 .用小載波片試驗(yàn)，微量展開劑展開5cm。 .圖解法： 樣品極性小，選吸附劑活性高，展開劑極性低的。 樣品極性大，選吸附劑活性低，展開劑極性高。 有機(jī)溶劑極性由小到大為： 石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有機(jī)酸類等。,c.展開的方式： 上行法、下行法、雙向展開、單向多次展開、雙向多次展開。 雙向展開：, 顯色： a.噴適當(dāng)?shù)娜芤海拱唿c(diǎn)顯色，即噴霧顯色。 b.噴有熒光反應(yīng)的物質(zhì)，在紫外光下觀察斑點(diǎn)。 c.將涂有熒光指示劑的薄層板放在紫外燈下觀察。 （涂板時(shí)把熒光指示劑加入到固體吸附劑中）,定性：在同一塊板上，同等條件下操作，被測(cè)樣與標(biāo)準(zhǔn)樣同時(shí)展開、顯色，同 Rf 值即是； 查手冊(cè)找相同的 Rf 值。 定量：a.目視定量法：以標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)對(duì)照，相當(dāng)于樣品斑點(diǎn)中含量ug數(shù)。 b.斑點(diǎn)面積定量法。 c.將樣點(diǎn)取下來，定容，離心，比色。 d.