1、菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定,哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生微生物學(xué)教研室,主要內(nèi)容,水樣的采集與送檢 菌落總數(shù)測定 大腸菌群測定 MPN法原理（拓展內(nèi)容）,水樣的采集和送檢,采樣瓶：洗凈、包扎、滅菌 自來水：燒灼龍頭，放水5-10min 中和余氯：每500ml水樣，預(yù)加1.5% Na2S2O3 2ml 水源水：距水面10-15cm 送檢時間：=2h(常溫) ，=4h(冷藏),采樣瓶,燒灼水龍頭,菌落總數(shù)測定,實驗?zāi)康?掌握菌落總數(shù)測定方法 實驗原理 不同稀釋度的水樣，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ，24h，菌落數(shù),菌落總數(shù)測定,器材與試劑： 水樣，無菌蒸餾水，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，10ml吸管，

2、平皿,菌落總數(shù)測定,實驗步驟 1.稀釋水樣： 10ml水樣加入90ml無菌蒸餾水、 振蕩、徹底混勻 2.做1：10系列稀釋 三支9ml無菌蒸餾水試管 3.傾注培養(yǎng) 1ml稀釋水樣、15ml培養(yǎng)基（45 ） 4.倒置培養(yǎng)：37 ，24h,傾注培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)果,菌落總數(shù)測定,實驗步驟 5.菌落計數(shù)： 肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記 必要時分區(qū)計數(shù)，菌落成片者作廢 計算方法 某稀釋度的菌落數(shù)：兩平板菌落數(shù)取平均值 選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度 （1）僅有一個稀釋度在此范圍： 菌落數(shù)稀釋倍數(shù),菌落總數(shù)測定,計算方法： （2）有兩個稀釋度在30-300之間 菌落數(shù)之比2，選較小值 菌落數(shù)之比300

3、取稀釋倍數(shù)最大者 （4）所有稀釋度均30 取稀釋倍數(shù)最小者 （5）沒有任何稀釋度在30-300之間 選最接近該范圍者 結(jié)果單位：CFU/ml,菌落總數(shù)測定,注意事項： 1.無菌操作 2.標(biāo)記 3.何時更換吸管 4.吸吹混勻 5.瓊脂培養(yǎng)基保溫 6.安全常識,大腸菌群數(shù)測定,實驗?zāi)康?實驗原理 37 ，24h，乳糖，產(chǎn)酸（溴甲酚紫），產(chǎn)氣（小倒管） 三步法：初發(fā)酵、分離培養(yǎng)、復(fù)發(fā)酵 器材與試劑 水樣、無菌蒸餾水、乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，革蘭染液 1ml吸管、10ml吸管、試管、平皿、載玻片,初發(fā)酵,器材與試劑 水樣、90ml無菌水、9ml無菌水、5ml三倍乳糖蛋白胨，10ml吸管、1m

4、l吸管、酒精燈、吸球,大腸菌群數(shù)測定,實驗步驟： 1.初發(fā)酵 （1）10ml水樣+3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（5ml） （2）三個稀釋度（原水樣，1:10和1：100）， 各取1ml+乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（10ml） （3）培養(yǎng)：37 ，24h （4）觀察指標(biāo)： 產(chǎn)酸（黃色），產(chǎn)氣（倒管內(nèi)有氣泡）,吸取水樣,加注水樣,初發(fā)酵結(jié)果,左2為陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生。,大腸菌群數(shù)測定,實驗步驟 2.分離培養(yǎng) （1）制備伊紅美藍(lán)平板： 45 ，無菌，傾注，15ml （2）選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管 （3）接種至伊紅美藍(lán)平板 分區(qū)劃線法 （4）培養(yǎng)： 37，24h,分離培養(yǎng),器材與試劑 初發(fā)酵結(jié)果（4

5、只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基,分區(qū)劃線法,分區(qū)劃線法,操作要點 1.劃下一個區(qū)前必須滅菌接種環(huán) 2.劃線時接種環(huán)同平板呈30-40角 3.每次劃線應(yīng)該壓到上一個區(qū)域的2-3條線 4.用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動,大腸菌群數(shù)測定,實驗步驟 2.分離培養(yǎng)： （5）菌落特征： 深紫黑色、有金屬光澤 紫黑色、無或略有金屬光澤 淡紫紅色、中心顏色深 （6）革蘭染色、鏡檢：選特征菌落,革蘭染色法,器材與試劑 結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復(fù)紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙,革蘭染色法,涂片：接種環(huán)，挑取菌落， 生理鹽水一滴，涂勻 熱固定：通過火焰若干次 初染：結(jié)晶紫一滴

6、，1min，水洗 媒染：盧戈碘液一滴，1min，水洗 脫色：95%乙醇，30s或至無色為止 復(fù)染：復(fù)紅一滴，30s,涂片,熱固定,初染,媒染,脫色,復(fù)染,革蘭氏染色陰性,革蘭氏染色陽性,革蘭染色法,復(fù)發(fā)酵,器材與試劑 培養(yǎng)24小時后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復(fù)發(fā)酵管,大腸菌群數(shù)測定,實驗步驟 3.復(fù)發(fā)酵 （1）選取鑒定為無芽孢G-桿菌的菌落1-3個 （2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 （3）培養(yǎng)：37，24h （4）觀察指標(biāo)：產(chǎn)酸，產(chǎn)氣,液體接種,復(fù)發(fā)酵,復(fù)發(fā)酵陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生,大腸菌群數(shù)測定,注意事項： 1.無菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.

7、顯微鏡保養(yǎng) 5.液體接種,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method） 目的：對某種細(xì)菌進(jìn)行選擇性計數(shù) 核心思想：泊松分布 實施方法：多次稀釋直至無菌，每個稀釋度分別接種若干培養(yǎng)管，根據(jù)陽性管數(shù)估算MPN值,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method） 1.細(xì)菌進(jìn)入發(fā)酵管的概率近似服從泊松分布: P(x=k)=e-x xk/k! x:細(xì)菌濃度，k:進(jìn)入發(fā)酵管的細(xì)菌數(shù) 2.若在n管發(fā)酵中，令接種水樣量為Vi，陽性管數(shù)為Pi，陰性管數(shù)為Qi，則該檢驗結(jié)果發(fā)生的概率為： 其中C為常系數(shù) V為總水樣量，x為細(xì)菌個數(shù),MPN法原理,3.當(dāng)y(x)max，XMPN 4.由于y(x)為單極值函數(shù)，令dy/dx=0,即 5.解此方程，得x=MPN 6.該方程為超越方程，一般采用數(shù)值法求近似解 7.日常實驗時采用查表法推算MPN值。 8.表格在教材第260-261頁。,飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn),菌落總數(shù)：不超過100 CFU/ml 大腸菌群：不得檢出,引自GB/T5750-2006,參考資料,張朝武.衛(wèi)生微生物學(xué)M.第四版.北京.人民衛(wèi)生出版社.2007:255-266 GB/T5750-2006.生活飲用水衛(wèi)生