1、顯微鏡直接計數(shù)法1.實驗目的1.闡明血細胞計數(shù)板的計數(shù)原理；2.掌握用血細胞計數(shù)板計數(shù)微生物的方法。二、實驗原理在顯微鏡下直接用血細胞計數(shù)板計數(shù)是一種常見的微生物計數(shù)方法。這種方法的優(yōu)點是直觀、快速。計數(shù)板(結構如圖1所示)是一種特殊的載玻片，其上的四個凹槽形成三個平臺。中間的平臺被一個短的橫向凹槽分成兩半，平臺的每一邊都刻有一個方形網(wǎng)格。每個方格被分成九個大方格，中間的大方格是計數(shù)室，在那里進行微生物的計數(shù)。計數(shù)室里有兩種秤，一種是把一個大方塊分成16個中間方塊，每個中間方塊分成25個小方塊；另一種是將一個大正方形分成25個中間正方形，每個中間正方形又分成16個小正方形。因此，不管什么樣的柜

2、臺板，每個大方塊中的小方塊數(shù)是一樣的，也就是說，有400個小方塊。如果每個大正方形的邊長為1，則每個大正方形的面積為12。蓋玻片蓋好后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1，因此計數(shù)室的容積為0.13。計算方法如下：讓五個正方形中的細菌總數(shù)為A，細菌溶液的稀釋倍數(shù)為b1.1625中計數(shù)器板的計算公式單元號/毫升=(A/5)1610000B=32000AB2.2516中計數(shù)器板的計算公式單元號/毫升=(A/5)2510000B=50000AB第三，實驗設備(1)細菌懸浮液：酵母懸浮液(2)其他物品：血細胞計數(shù)板、顯微鏡、蓋玻片、無菌毛細管等。四.實驗步驟1.稀釋：適當稀釋酵母懸浮液。如果細菌溶液沒有

3、濃縮，就沒有必要稀釋。(通常，樣品的稀釋需要每個細胞中大約5-10個細菌。(2.計數(shù)室的顯微鏡檢查：在添加樣品之前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行顯微鏡檢查。如果有污垢，需要在計數(shù)前清洗干凈。3.加樣：用蓋玻片覆蓋干凈干燥的血細胞計數(shù)板，然后用無菌小滴管從蓋玻片邊緣滴一小滴稀釋的酵母液(不要太多)，使菌液沿縫隙通過毛細滲透進入計數(shù)室，然后靜置5-10分鐘進行計數(shù)。4.顯微鏡計數(shù)：將血細胞計數(shù)板放在顯微鏡臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室的位置，然后用高倍鏡進行計數(shù)。如果選擇2516尺寸的計數(shù)板，則每個計數(shù)室內選擇五個中間正方形，并選擇四個角和中間正方形(即80個小正方形)；如果選擇1625大小的計數(shù)板，請在四

4、個中間正方形(即100個小正方形)的四個角(左上角、右上角、左下角和右下角)中計數(shù)細菌。做記錄。5.血細胞計數(shù)板的清洗：使用后，清洗血細胞計數(shù)板，干燥后返回。V.實驗原始過程的記錄血細胞計數(shù)板尺寸2516實驗現(xiàn)象(1)血細胞計數(shù)板的結構在顯微鏡視野中清晰可見，符合實驗原理；與此同時，觀察到一點污漬。(2)在蓋玻片邊緣滴一小滴細菌懸液后，細菌懸液迅速充滿計數(shù)室，沒有氣體飽和；(3)視野中清晰可見許多白色小顆粒(形狀像魚卵)，有些細胞處于出芽和繁殖階段，有些明顯形成芽。(4)逐漸稀釋后，一邊的細胞變得非常密集，而另一邊比稀釋前薄得多，這可以在計數(shù)室的最小正方形中計數(shù)細胞的數(shù)量。每個正方形中的細菌數(shù)

5、量如表1所示：表1:每個細胞中細菌數(shù)量的記錄和處理表a代表五個正方形中的細菌總數(shù)；b代表細菌液體的稀釋倍數(shù)。會計室每個細胞中的細菌數(shù)量AB細菌計數(shù)/毫升兩室平均12345第一個房間9250761108341124110000057350000上議院6844849676368473600000細菌數(shù)量/毫升=(A/5)2510000B=50000AB六.結果和分析(1)實驗結論和分析1.1毫升酵母中約有57350000個酵母細胞在本實驗中，1毫升酵母懸浮液中酵母細胞的數(shù)量只能是一個近似值。原因是多方面的，計數(shù)板有內在的錯誤，這是不可避免的；此外，實驗者在相對狹窄的顯微鏡視野中進行計數(shù)，并且使用的

6、計數(shù)規(guī)則因人而異，導致更大的誤差。錯誤的來源和如何提高實驗的準確性可以在思考問題的筆記和答案中找到。(2)、注意事項：1.不要貪圖添加樣品，一般滴一滴(最多兩滴)，計數(shù)室內不會產(chǎn)生氣泡。2.當計數(shù)時，網(wǎng)格線上的細菌通常只計數(shù)上面和右邊線上的細菌。在酵母發(fā)芽的情況下，當芽體的大小達到母細胞的一半時，計數(shù)兩個菌體。對來自兩個計數(shù)室的樣本值進行計數(shù)，以計算樣本中的細菌含量。3.用水龍頭下的水柱沖洗血細胞計數(shù)板。不要用硬物清洗。洗完后，自己擦干或用吹風機吹干。顯微鏡下，觀察每個細胞中是否有殘留細菌或其他沉淀物。如果不干凈，必須反復清洗，直到干凈為止。(3)思考考試問題1.根據(jù)你的經(jīng)驗，血細胞計數(shù)板的主

7、要錯誤是什么？如何最大限度地減少誤差并力求準確？回答：一、系統(tǒng)錯誤：一、儀器不夠精確，如：計數(shù)板磨損導致刻度不均勻，顯微鏡鏡頭磨損等。.細胞分布不均b、意外錯誤：操作人員設備操作和使用不當，稀釋不準確，細胞識別錯誤：如蓋玻片、吸管、計數(shù)板等不干凈。顯微鏡視野不亮等。c、措施系統(tǒng)誤差可以通過標準化操作、提高熟練程度和校正儀器來避免或校正，但細胞分布誤差很難完全消除。以下措施可以減少意外錯誤：(1)所有使用的設備應清潔干燥，計數(shù)板和蓋玻片的規(guī)格應符合要求或經(jīng)過校正。(2)制得的酵母懸液濃度適宜，易于稀釋，等滲、新鮮、無雜質顆粒。(3)應滴加適量的菌懸液，稀釋比例不宜過大。一般樣品的稀釋率應為每個細胞中約5-10個細菌。(4)嚴格操作