1、內(nèi)容提要： 1.微生物生長(zhǎng)繁殖的概念 2.微生物生長(zhǎng)繁殖的測(cè)定方法 3.微生物的典型生長(zhǎng)曲線及不同時(shí)期的特點(diǎn) 4.微生物的連續(xù)培養(yǎng)方法和應(yīng)用,第七章 微生物的生長(zhǎng)繁殖,生物個(gè)體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致個(gè)體 體積擴(kuò)大的生物學(xué)過(guò)程。,生長(zhǎng)：,生物個(gè)體生長(zhǎng)到一定階段，通過(guò)特定方式產(chǎn)生新的 生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過(guò)程。,繁殖：,生長(zhǎng)是一個(gè)逐步發(fā)生的量變過(guò)程， 繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的質(zhì)變過(guò)程。,在高等生物里這兩個(gè)過(guò)程可以明顯分開(kāi)，但在低等特別是在單細(xì)胞的生物里，由于細(xì)胞小，這兩個(gè)過(guò)程是緊密聯(lián)系又很難劃分的過(guò)程。,微生物生長(zhǎng)繁殖的相關(guān)概念,發(fā)育：微生物的生長(zhǎng)與繁殖是個(gè)交替過(guò)程

2、，從生長(zhǎng)到繁殖的量變到質(zhì)變的過(guò)程是發(fā)育。 群體生長(zhǎng)個(gè)體生長(zhǎng)+個(gè)體繁殖 可以用重量、體積、群體濃度或密度指標(biāo)來(lái)測(cè)定。,一般微生物的研究和應(yīng)用中，只有群體的生 長(zhǎng)才有意義，所以通常講的“生長(zhǎng)”是指群體生長(zhǎng)。,一個(gè)微生物細(xì)胞,合適的外界條件，吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行代謝。,如果同化作用的速度超過(guò)了異化作用,個(gè)體的生長(zhǎng) 原生質(zhì)的總量（重量、體積、大?。┚筒粩嘣黾?如果各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L(zhǎng)時(shí)，則達(dá)到一定程度后就 會(huì)發(fā)生繁殖，引起個(gè)體數(shù)目的增加。,群體內(nèi)各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(zhǎng),群體的生長(zhǎng),（1）概念 細(xì)菌兩次細(xì)胞分裂的時(shí)間間隔。 （2）影響 正常情況下，世代時(shí)間穩(wěn)定 世代時(shí)間受培養(yǎng)環(huán)境的影響。 不同的微生

3、物，生長(zhǎng)繁殖速度不同，世代時(shí)間也有不同。 一般，原核微生物的繁殖速度大于真核微生物。好氧微生物快于厭氧微生物。,2.世代時(shí)間,第一節(jié) 微生物的純培養(yǎng),一、純培養(yǎng)的定義,微生物在自然界中都是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一種微生物，必須把它眾混雜的微生物類群分離出來(lái)，以得到只含有一種微生物的培養(yǎng)。 微生物學(xué)中將在實(shí)驗(yàn)條件下，從一個(gè)細(xì)胞或同種細(xì)胞群繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng)。,二、純培養(yǎng)的分離方法,平板劃線分離法 稀釋倒平板法 單孢子或單細(xì)胞分離法 利用選擇性培養(yǎng)基分離法,（一）平板劃線分離法,用接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生

4、物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。,（二）稀釋倒平板法,先將待分離的材料用無(wú)菌水作一系列的稀釋（如10、100、1000、10000倍），然后分別取不同稀釋液少許，與已溶化并冷卻至45左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出出菌落。稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。,（三）單孢子或單細(xì)胞分離法,采取顯微分離法從混雜

5、群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)孢子進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。 單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的 微生物如藻類、原生動(dòng)物容易，個(gè)體較小的細(xì)菌較難。 對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。,（四）利用選擇性培養(yǎng)基分離法,各種微生物對(duì)不同的化學(xué)試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制合適某種微生物而限制其它微生物生長(zhǎng)的選擇培養(yǎng)基，用它來(lái)培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。 另外，還可以將樣品預(yù)處理，消除不希望分離到的微生物。如加溫殺死營(yíng)養(yǎng)菌體而保留芽孢，過(guò)濾去除絲狀菌體而保留單孢子。,微生物純培養(yǎng)分離方法的比較,測(cè)生長(zhǎng)量,直接法 間接法,測(cè)體積 稱干重,含氮量

6、 生理指標(biāo)法 （耗氧量，酶活性等）,三、微生物生長(zhǎng)繁殖的測(cè)定方法,1、 生理指標(biāo)法,微生物的生理指標(biāo)，如呼吸強(qiáng)度，耗氧量、酶活性、 生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關(guān)。 樣品中微生物數(shù)量多或生長(zhǎng)旺盛，這些指標(biāo)愈明顯， 因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量 熱計(jì)等設(shè)備來(lái)測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)。,常用于對(duì)微生物的快速鑒定與檢測(cè),2、計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法,缺點(diǎn)： 不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,3、平板菌落計(jì)數(shù)法,樣品充分混勻；,每支移液管及涂布棒只能接觸一個(gè) 稀釋度的菌液；,同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù),取平均值；,每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適，

7、便于 準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；,一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成單位（colony forming units， CFU）來(lái)表示，而 不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。,4、液體稀釋法,主要適用于只能進(jìn)行液體培養(yǎng)的微生 物，或采用液體鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行直接 鑒定并計(jì)數(shù)的微生物。,對(duì)未知樣品進(jìn)行十倍稀釋，然后根據(jù)估算取三個(gè)連續(xù)的稀釋度 平行接種多支試管，對(duì)這些平行試管的微生物生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)，長(zhǎng)菌的為陽(yáng)性，未長(zhǎng)菌的為陰性，然后根據(jù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)計(jì)算 出樣品中的微生物數(shù)目。,5、比濁法,在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密 度，以光密度(optical density, 即O.D.) 表示菌量。,實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)應(yīng)

8、控制在菌濃度與光密度 成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。,一、培養(yǎng)方法 分批培養(yǎng)：將少量細(xì)菌接種于一定量的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在適宜的溫度下培養(yǎng)，并定時(shí)取樣測(cè)定活細(xì)菌數(shù)目或重量的變化。 連續(xù)培養(yǎng)：流入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)不斷流出培養(yǎng)物的培養(yǎng)方式，即一方面連續(xù)進(jìn)料，另一方面又連續(xù)出料的培養(yǎng)方式,第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)曲線,二、細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線 將少量菌種接種在適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔一定時(shí)間取樣，計(jì)算菌數(shù)，以菌數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。,典型生長(zhǎng)曲線，只適用于單細(xì)胞微生物如細(xì)菌和酵母菌，對(duì)于絲狀生長(zhǎng)的真菌或放線菌，只能獲得非典型的生長(zhǎng)曲線,典型生長(zhǎng)曲線 細(xì)分：停滯期(適應(yīng)期)、加速期、對(duì)數(shù)期、減

9、速期、靜止期、衰 亡期 粗分：停滯期(適應(yīng)期)、對(duì)數(shù)期、靜止期、衰亡期。,1. 停滯期 又稱適應(yīng)期，指少量微生物接種到新培養(yǎng)液中后，在開(kāi)始培養(yǎng)的一段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不增加的時(shí)期。,為什么會(huì)出現(xiàn)停滯期呢？,適應(yīng)環(huán)境（合成相應(yīng)的酶） 營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備（用于復(fù)制合成）,“萬(wàn)事開(kāi)頭難”,（一）特點(diǎn) 生長(zhǎng)速率常數(shù)等于零 細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng) 細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高， 原生質(zhì)呈嗜堿性 合成代謝活躍 對(duì)外界不良條件反應(yīng)敏感,（二）影響停滯期長(zhǎng)短的因素 接種菌齡：接種齡即“種子” 的群體生長(zhǎng)年齡，亦即它 處在生長(zhǎng)曲線上的哪一個(gè)階段。實(shí)驗(yàn)證明，如果以對(duì)數(shù)期接種齡的“種子”接種，則子代培養(yǎng)物的停滯期就短。 接種量

10、：接種量的大小明顯影響停滯期的長(zhǎng)短。（基數(shù)大） 營(yíng)養(yǎng)：營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中停滯期短；營(yíng)養(yǎng)貧乏培養(yǎng)基中停滯期長(zhǎng)。,2. 指數(shù)期 又稱對(duì)數(shù)期，是指在生長(zhǎng)曲線中，緊接著延滯期的一個(gè)細(xì)胞以幾何級(jí)數(shù)速度分裂的一段時(shí)期。,（一）特點(diǎn) 生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大，因而細(xì)胞每分裂一次所需的代 時(shí)G或原生質(zhì)增加一倍所需的倍增時(shí)間最短； 細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體內(nèi)各種成分最為均勻； 酶系活躍，代謝旺盛。,指數(shù)期的微生物可作為代謝、生理等研究的良好材料，是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”的最佳種齡。,（二）指數(shù)生長(zhǎng)公式,Nx= N02n LgNx=lgN0+nlg2 n =（lgNx-lgN0 )/lg2 =(lgNx-lgN0)/0.3

11、01 G = (tx-t0)/n,t0 tx,NX N0,（三）影響指數(shù)期的因素,菌種： 不同菌種的代時(shí)差異極大 營(yíng)養(yǎng)成分：營(yíng)養(yǎng)越豐富，代時(shí)越短 營(yíng)養(yǎng)物濃度：影響微生物的生長(zhǎng)速率和總生長(zhǎng)量 培養(yǎng)溫度：影響微生物的生長(zhǎng)速率,是代謝、生理研究的良好材料 是增殖噬菌體的最適宿主菌齡 是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”的最佳種齡 G染色鑒定時(shí)采用此期微生物,（四）指數(shù)期的應(yīng)用,3. 穩(wěn)定期 又稱靜止期或最高生長(zhǎng)期。 (一) 特點(diǎn) 細(xì)胞數(shù)目不增加，即處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)相等的動(dòng)態(tài)平衡之中 菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)，而且菌體產(chǎn)量與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗間呈現(xiàn)出一定的比例關(guān)系 細(xì)胞長(zhǎng)、大 對(duì)不良

12、條件敏感，抵抗力降低 形成糖原、異染顆粒等貯藏物 多數(shù)芽孢桿菌開(kāi)始形成芽孢 有的微生物開(kāi)始合成抗生 素等次生代謝產(chǎn)物,（二）穩(wěn)定期到來(lái)的原因 營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡； 營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如CN比值不合適等； 有害代謝產(chǎn)物的累積； pH、氧化還原勢(shì)等物化條件越來(lái)越不適宜。,生產(chǎn)菌種的發(fā)酵廠在穩(wěn)定期初期收獲菌體或代謝產(chǎn)物。 此外，由于對(duì)穩(wěn)定期到來(lái)的原因進(jìn)行研究，還促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的設(shè)計(jì)和研究。,（三）穩(wěn)定期的應(yīng)用,（一）特點(diǎn) 個(gè)體死亡的速度超過(guò)新生的速 度(繁殖數(shù)死亡數(shù))，整個(gè)群 體就呈現(xiàn)出負(fù)生長(zhǎng) 細(xì)胞形態(tài)多樣，例如會(huì)產(chǎn)生很多膨大、不規(guī)則的退化形態(tài) 利用貯藏物進(jìn)行內(nèi)源呼吸，發(fā)生自溶 有

13、的微生物在這時(shí)產(chǎn)生或釋放對(duì)人類有用的抗生素等次生代謝產(chǎn)物 在芽孢桿菌中，芽孢釋放往往也發(fā)生在這一時(shí)期,4.衰亡期,主要是外界環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)越來(lái)越不利，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過(guò)合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。 營(yíng)養(yǎng)物耗盡，細(xì)菌利用貯存顆粒進(jìn)行內(nèi)源呼吸造成自身溶解； 有毒代謝物積累，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等。,（二）衰亡期的原因,與菌種的遺傳特性有關(guān): 有些細(xì)菌的培養(yǎng)經(jīng)歷所有的各 個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，幾天以后死亡，有些細(xì)菌培養(yǎng)幾個(gè)月乃至 幾年以后仍然有一些活的細(xì)胞； 與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)有關(guān)：補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和能源，以及中 和環(huán)境毒性，可以減緩死亡期細(xì)胞的死亡速率，延長(zhǎng)細(xì) 菌培養(yǎng)物的存活時(shí)間。,（三）影響衰亡期的因素,

14、兩種連續(xù)培養(yǎng)方式： 恒濁連續(xù)培養(yǎng) 恒化連續(xù)培養(yǎng),三、細(xì)菌的連續(xù)培養(yǎng),測(cè)定所培養(yǎng)微生物的光密度值,自動(dòng)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速,使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度,當(dāng)培養(yǎng)室中的濁度超過(guò)預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速加快，使?jié)岫冉档停?當(dāng)培養(yǎng)室中的濁度低于預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速減慢，使?jié)岫壬撸?恒濁培養(yǎng)器的工作精度是由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來(lái)決定的,如果所用培養(yǎng)基中有過(guò)量的必需營(yíng)養(yǎng)物，就可以使菌體維持最高的 生長(zhǎng)速率。,1.恒濁連續(xù)培養(yǎng),維持培養(yǎng)液中細(xì)菌的濃度恒定，以濁度為控制指標(biāo)的培養(yǎng)方式。,設(shè)備：恒化器 是一種以恒定流速進(jìn)水，以相同速率流出代謝產(chǎn)物，使細(xì)菌始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條 件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的一

15、種 連續(xù)培養(yǎng)裝置。 通過(guò)控制某一種營(yíng)養(yǎng)物的 濃度，使其始終成為生長(zhǎng) 限制因子的條件下達(dá)到的。,2.恒化連續(xù)培養(yǎng),維持反應(yīng)器中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度基本不變的連續(xù)培養(yǎng)方式。,在連續(xù)培養(yǎng)中，微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)和規(guī)律與分批培養(yǎng)不同，往往是處在相當(dāng)于分批培養(yǎng)中生長(zhǎng)曲線的某一生長(zhǎng)階段。 如：廢水生物處理的連續(xù)運(yùn)行過(guò)程中，活性污泥中的微生物處在相當(dāng)于分批培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線的生長(zhǎng)階段：加速期或?qū)?shù)期，或靜止期或衰亡期。,3.連續(xù)培養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律,四、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線在廢水生物處理中的應(yīng)用,在廢水生物處理的連續(xù)運(yùn)行過(guò)程中，活性污泥中的微生物只是處于間歇培養(yǎng)曲線的某一生長(zhǎng)階段。 對(duì)數(shù)期：微生物活力強(qiáng)，但不易凝聚和沉淀 ；有機(jī)物出 水濃度相對(duì)較高。 靜止期：污泥代謝活性和絮凝沉降性能均較好。 衰亡期：有機(jī)物含量低，BOD5/CODCr小于0.3的廢水，用 延時(shí)曝氣法。,常規(guī)活性污泥法：利用靜止期； 生物吸附法