1、工業(yè)微生物,第六節(jié)微生物的生長規(guī)律,微生物的特點：,個體微小,肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個 單個的微生物組成的群體。,微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體繁殖生長。,對細菌群體生長規(guī)律的了解是對其進行研究與利用的基礎(chǔ),一、微生物的個體生長和同步生長 1. 微生物個體細胞的生長,（1）細菌的生長,一個新生的細胞長大到最后分裂為兩個子細胞的過程稱為細胞周期。在細胞周期內(nèi)主要的細胞學(xué)變化是細胞的表面生長即細胞壁的增生、DNA的復(fù)制以及細胞分裂成子代細胞。,細菌培養(yǎng)物在培養(yǎng)條件下度過的時間稱為細菌的菌齡。,（2）酵母菌的生長,酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌細胞的生長芽細胞的生長。

2、,酵母菌的細胞周期是兩次細胞分裂之間的時間，這個周期分為四個時期： 間隔期G1、 DNA合成期S、 第二間隔期G2、 有絲分裂期M.,（3）霉菌的生長,絲狀真菌的生長時從孢子萌發(fā)開始的，以其菌絲頂端延長的方式進行的。當菌絲伸長到一定程度后就會出現(xiàn)分枝。,2. 微生物的同步生長,目前使用的方法：,（1）電子顯微鏡觀察細胞的超薄切片,設(shè)法使某一群體中的所有個體細胞盡可能都處于同樣細胞生長和分裂周期中，通過分析此群體在各階段的生物化學(xué)特性變化，來間接了解單個細胞的相應(yīng)變化規(guī)律。,（2）同步培養(yǎng)（synchronous culture ）技術(shù),這種通過同步培養(yǎng)的手段而使細胞群體中各個體處于分裂步調(diào)一致

3、的生長狀態(tài)，稱為同步生長（synchronous growth）。,獲得微生物同步生長的方法：,（1）環(huán)境條件誘導(dǎo)法 氯霉素抑制細菌蛋白質(zhì)合成； 細菌芽孢誘導(dǎo)發(fā)芽； 藻類細胞的光照、黑暗控制； 用EDTA或離子載體處理酵母菌； 短期熱休克（40）法等。,（2）機械篩選法 利用處于同一生長階段細胞的體積、大小的相同性，用過濾法、區(qū)帶密度梯度離心法或膜洗脫法收集同步生長的細胞。,有效和常用的方法 Helmstetter-Cummings技術(shù),由于細胞的個體差異， 同步生長往往只能 維持2-3個世代， 隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?隨機生長。,二、單細胞微生物的典型生長曲線,生長曲線（Growth Curve）

4、：,定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線，稱為生長曲線（growth curve）。,在微生物學(xué)中提到的“生長”，均指群體生長。,細菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細胞數(shù)量。,以培養(yǎng)時間為橫座標,以菌數(shù)為縱座標,作圖,得到的一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線！,根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growthrateconstant），即每小時的分裂次數(shù)（R）的不同，一般可把典型生長曲線粗分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等4個時期 。,延滯期,指數(shù)期,穩(wěn)定期,衰亡期,延滯期,指數(shù)期,穩(wěn)定期,衰亡期,又稱停滯期、調(diào)整期和適應(yīng)期。指少量單細胞微生物接種到新鮮培養(yǎng)基后，在開始培

5、養(yǎng)的一段時間內(nèi)細胞數(shù)目不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零的一段時期代謝系統(tǒng)是正在適應(yīng)新環(huán)境。,（一）延滯期（Lag phase）,延滯期,分裂遲緩、代謝活躍, 生長速率常數(shù)為零； 細胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌可長成絲狀， Eg.巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）在延滯期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍； 一般來說處于遲緩期的細菌細胞體積最大！,1. 延滯期的特點,細胞處于活躍生長中，只是分裂遲緩。 在此階段后期，少數(shù)細胞開始分裂，曲線略有上升。, 細胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高； 合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP合成加速，易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶； 對外界不良條件

6、如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素反應(yīng)敏感。,微生物接種到一個新的環(huán)境，暫時缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。,調(diào) 整 代 謝,2. 遲緩期出現(xiàn)的原因,（1）菌種的遺傳性,影響延滯期長短的因素很多,（2）接種齡 指接種物或種子（inoculum，復(fù)數(shù)inocula）的生長年齡，亦即它處在生長曲線上哪一個階段時用來作種子的。這里指某一群體的生理年齡。,（3）接種量 接種量的大小明顯影響延滯期的長短。,在發(fā)酵工業(yè)上，為縮短延滯期以縮短生產(chǎn)周期，提高發(fā)酵效率，一般采用較大的接種量。,種子：發(fā)酵培養(yǎng)基1：10，V/V,（

7、4）培養(yǎng)基成分,發(fā)酵生產(chǎn)中,發(fā)酵培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)基,成分盡量接近,（1）通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使延滯期縮短；,（2）利用對數(shù)生長期的細胞作為種子；,（3）盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；,（4）適當擴大接種量；,3. 生產(chǎn)實踐中縮短延滯期的常用手段,（二）對數(shù)生長期（ Logarithmic phase ）,又稱指數(shù)生長期（Exponential phase）。指在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時期 。,指數(shù)期,1. 對數(shù)生長期的特點, 生長速率常數(shù)R最大，因而細胞每分裂一次所需的時間代時（generation time ，G，又稱世代時間或增代時間

8、）或原生質(zhì)增加一倍所需的倍增時間（doubling time）最短； 細胞進行平衡生長（balanced growth），菌體各部分的成分十分均勻； 酶系活躍，代謝旺盛；,對數(shù)生長期的細菌個體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長迅速、代時穩(wěn)定，所以是研究微生物基本代謝及遺傳特性的良好材料。它也常在生產(chǎn)上用作種子，使微生物發(fā)酵的遲緩期縮短，提高經(jīng)濟效益。,2. 對數(shù)生長期的3個重要參數(shù),（1）繁殖代數(shù)（n）,x2=x12,lgx2lgx1 n = =3.322（lgx2lgx1） lg2,（2）生長速率常數(shù)（R）,n 3.322（lgx2lgx1） R = = t2t1 t2t1,

9、（3）代時（G）,1 t2t1 G = = R 3.322（lgx2lgx1）,在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間為代時（Generation time）； 在群體生長里細菌數(shù)量增加一倍所需的時間稱為倍增時間（Doubling time）。,影響微生物增代時間（代時）的因素, 菌種，不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同；, 營養(yǎng)成分，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時短，反之則長；(37，E.coli在牛奶12.5min，肉湯17.0min）, 營養(yǎng)物濃度，營養(yǎng)物的濃度可影響微生物的生長速率和生長總量 ，在一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比；,凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速

10、率的營養(yǎng)物成分，就稱為生長限制因子（growyh-limited factor）。, 培養(yǎng)溫度，在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。,（三）穩(wěn)定期（ stationary phase）,又稱恒定期或最高生長期。其特點是生長速率常數(shù)R等于0，即處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等，或正生長與負生長相等的動態(tài)平衡之中。,穩(wěn)定期,這時的菌體產(chǎn)量達到了最高點，而且菌體產(chǎn)量與營養(yǎng)物質(zhì)的消耗間呈現(xiàn)出一定的比例關(guān)系，這一關(guān)系就是生長產(chǎn)量常數(shù)Y（或稱生長得率，growth yield）。,xx0 xx0 Y = = C0C C0,x穩(wěn)定期時的細胞干重（gml培養(yǎng)液）， x0剛接種時的細胞干重， C0 限制

11、性營養(yǎng)物的最初濃度（gml）， C 穩(wěn)定期時限制性營養(yǎng)物的濃度（由于計算Y時必須用限制性營養(yǎng)物，所以C應(yīng)等于0）。,進入穩(wěn)定期，細胞重要的分化調(diào)節(jié)階段， 細胞內(nèi)開始積聚糖原、異染顆粒和脂肪等內(nèi)含物； 芽孢桿菌一般在這時開始形成芽孢或建立自然感受態(tài)等； 有的微生物在穩(wěn)定期時還開始合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物（secondary metabolites）穩(wěn)定期產(chǎn)物（idiolites）。,以指數(shù)期為主的菌體生長期（trophophase）,以穩(wěn)定期為主的代謝產(chǎn)物合成期（idiophase）,生長期,穩(wěn)定期到來的原因, 營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡； 營養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如CN比值不合適等； 酸、醇、

12、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積； pH、氧化還原勢等理化條件越來越不適宜等。,以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物（SCP、乳酸等）為目的的某些發(fā)酵生產(chǎn)來說，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期；,對生產(chǎn)實踐的指導(dǎo)意義,對維生素、堿基、氨基酸等物質(zhì)進行生物測定（bioassay）來說，穩(wěn)定期是最佳測定時期；,通過對穩(wěn)定期到來原因的研究，還促進了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建。,可延長穩(wěn)定生長期，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物。,生產(chǎn)上 的措施,補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）,取走代謝產(chǎn)物,調(diào)節(jié)pH,調(diào)節(jié)溫度,對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩,（四）衰亡期（ decline phase或death

13、phase）,在衰亡期中，個體死亡的速度超過新生的速度，整個群體呈現(xiàn)負生長狀態(tài)（R為負值）。,衰亡期,細胞形態(tài)發(fā)生多形化， 例如會發(fā)生膨大或不規(guī)則的退化形態(tài)； 有的微生物因蛋白水解酶活力的增強而發(fā)生自溶（autolysis）； 有的微生物在這一期合成或釋放對人類有益的抗生素等次生代謝產(chǎn)物； 在芽孢桿菌中，芽孢釋放等。,產(chǎn)生衰亡期的原因 外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，Eg.營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累等，從而引起細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。,該時期死亡的細菌以對數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細菌產(chǎn)生抗性也會使細菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。,由于采用

14、活菌計數(shù)比較麻煩，并要求嚴格進行操作，否則不易得到準確的結(jié)果，重復(fù)性也差，因此在實際工作中多采用分光光度計測定OD值的方法繪制細菌的生長曲線。,三、微生物的連續(xù)培養(yǎng),將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中， 經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲。,分批培養(yǎng)（batch culture）or 密閉培養(yǎng)（closed culture）,培養(yǎng)基一次加入，不予補充，不再更換。,連續(xù)培養(yǎng)（Continous culture ）,又稱開放培養(yǎng)（open culture），在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。,培養(yǎng)過程中不斷的補充營養(yǎng)物質(zhì) 和以同樣的速率移出培

15、養(yǎng)物 是實現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。,控制連續(xù)培養(yǎng)的方法,恒濁連續(xù)培養(yǎng),不斷調(diào)節(jié)流速而使細菌培養(yǎng)液濁度保持恒定,恒化連續(xù)培養(yǎng),保持恒定的流速,link1,四、微生物的高密度培養(yǎng),微生物的高密度培養(yǎng)（high cell-density culture，HCDC）也稱高密度發(fā)酵，一般是指微生物在液體培養(yǎng)中細胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)。,現(xiàn)代高密度培養(yǎng)技術(shù)主要是在用基因工程菌（尤其是E. coli）生產(chǎn)多肽類藥物的實踐中逐步發(fā)展起來的。 Eg. 人生長激素、胰島素、白細胞介素類和人干擾素等。,提高,菌體培養(yǎng)密度,產(chǎn)物的比生產(chǎn)率 （單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量）,減少,培

16、養(yǎng)容器的體積,培養(yǎng)基的消耗,“下游工程”（down-stream processing）中分離、提取的效率,生產(chǎn)周期,設(shè)備投入,生產(chǎn)成本,重要的實踐價值,高密度培養(yǎng)的具體方法：,（1）選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量。,（2）補料，這是工程菌高密度培養(yǎng)的重要手段之一。,（3）提高溶解氧的濃度，提高好氧菌和兼性厭氧菌培養(yǎng)時的溶氧量也是高密度培養(yǎng)的重要手段之一。,（4）防止有害代謝產(chǎn)物的生成。,本章小結(jié),1. 營養(yǎng)是一切生命活動所需物質(zhì)之源,水 碳源 氮源,微生物6大類營養(yǎng)要素 碳源、氮源、無機鹽、能源、生長因子、水,2. 微生物的營養(yǎng)類型,按微生物所需碳源和能源的性質(zhì)分為四大類： 化能異養(yǎng)微生物（

17、最多） 化能自養(yǎng)微生物 光能異養(yǎng)微生物 光能自養(yǎng)微生物,3. 微生物的營養(yǎng)的方式,有細胞構(gòu)造的微生物營養(yǎng)方式都是滲透營養(yǎng)型。 單純擴散、促進擴散、主動運輸和基團移位,4. 設(shè)計和配置培養(yǎng)基的原則和方法,4個原則： 目的明確、營養(yǎng)協(xié)調(diào)、理化適宜和經(jīng)濟節(jié)約 4個方法： 生態(tài)模擬、查閱文獻、精心設(shè)計和試驗比較,5. 培養(yǎng)基的種類,天然培養(yǎng)基、組合培養(yǎng)基和半組合培養(yǎng)基； 液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基； 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、 選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基； 種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和保種培養(yǎng)基。,6. 測量微生物生長繁殖的方法,直接法（測體積法、稱干重法等） 間接法（比濁法、生理指標法

18、等）,測生長量 計繁殖數(shù),直接法（計數(shù)板計數(shù)法等） 間接法（活菌計數(shù)法等）,7. 典型的生長曲線,單細胞微生物在密閉狀態(tài)液體培養(yǎng)基中群體變化規(guī)律 4個生長期 延滯期 指數(shù)期 穩(wěn)定期 衰亡期,復(fù)習(xí)思考題,設(shè)計一張表格，比較一下微生物6類營養(yǎng)要素。 2. 設(shè)計表格，比較微生物的4大營養(yǎng)類型。 3. 設(shè)計表格，比較四種營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的方式。 4. 對培養(yǎng)基的種類列表表示。 5.什么叫典型生長曲線？它可分幾期？每個生長期的特點是什么？,（一）恒濁連續(xù)培養(yǎng),恒濁器（turbidostat）是一種根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細胞的連續(xù)培養(yǎng)器。,測定所培養(yǎng)微生物的光密度值,自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速,使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度,當培養(yǎng)室中的濁度超過預(yù)期數(shù)值時，流速加快，使?jié)岫冉档停?當培養(yǎng)