1、1,實驗二 BCA法測定蛋白質(zhì)濃度(BCA protein concentration determination ),耿 磊 生物化學(xué)教研室 （301室） 郵箱：,2,注意事項,前 言,實驗?zāi)康?實驗原理,思 考,實驗步驟,3,前 言,一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),？,（一）、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) （二）、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點 （三）、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝聚 （四）、蛋白質(zhì)的紫外吸收 （五）、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),4,（一）、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：顆粒表面電荷、水化膜,5,（二）、

2、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點,蛋白質(zhì)的兩性電離 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基 側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電 荷或正電荷的基團(tuán)。 蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子 的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH 稱為蛋白質(zhì)的等電點。,6,（三）、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝聚,* 蛋白質(zhì)的變性(denaturation) 在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破 壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其 理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。 * 蛋白質(zhì)沉淀（

3、precipitation） 在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互 纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉 淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。 * 蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation) 蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此 凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,7,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。,（四）、蛋白質(zhì)的紫外吸收,8,（五）、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),蛋白質(zhì)分子中的肽鍵及氨基酸殘基的各種特殊基團(tuán)，在一定條件下可以和某些化學(xué)試劑呈

4、現(xiàn)一定的顏色反應(yīng)，顏色的深淺與其濃度成正比。 茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction) 雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction) 3.Folin-酚試劑反應(yīng),9,二、蛋白質(zhì)的測定方法,？,（一）紫外線吸收法 （二）雙縮脲法 （三）Folin-酚試劑法 （四)考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法 （五）改良微量凱式定氮法 （六）BCA法,10,(一）紫外吸收法,由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作 定量測定。 優(yōu)點：是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度

5、鹽類不干擾測定。 缺點：準(zhǔn)確度較差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干擾測定。,11,（二）雙縮脲法,H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 雙縮脲 雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲在堿性條件下與銅離子結(jié)合生成紫紅色化合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。 優(yōu)點：操作簡便、迅速、受蛋白質(zhì)性質(zhì)影響較小。 缺點：靈敏度較差，本法測定蛋白質(zhì)范圍1-20mg； 特異性不高,12,蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵(CONH)，因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物。Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)Folin試劑(磷鉬酸磷鎢酸試劑)，蛋白質(zhì)銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸磷鎢

6、酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強度與蛋白質(zhì)的量成正比例。 優(yōu)點：是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏1020倍，較雙縮脲法靈敏100倍。 缺點：其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。,（三）Folin-酚試劑法,13,考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性條件下能與蛋白質(zhì)結(jié)合， 使染料的最大吸收峰值從465nm變成595nm，溶液的顏色 由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃 度成正比，故可用于蛋白質(zhì)定量測定。 優(yōu)點：簡單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高（比Lowry法 靈敏4倍）。 缺點：用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差；大量去垢 劑會使顯色反應(yīng)受到干擾；標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性；

7、比色 杯染色嚴(yán)重，影響重復(fù)性。,（四)考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法,14,蛋白質(zhì)是機(jī)體內(nèi)主要的含氮物質(zhì)，而且氮元素的含量相 當(dāng)恒定，一般為16%，其他非蛋白質(zhì)的含氮化合物所占得氮 量甚微。因此，測定生物樣品的含氮量，即可推算蛋白質(zhì)含 量。 優(yōu)點：準(zhǔn)確度高，可測定不同形態(tài)樣品。 缺點：靈敏度低，適用于0.21.0mg氮，誤差為2費 時。,（五）改良微量凱式定氮法,15,（六）BCA法,堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA試劑形成 紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲 線對比，即可計算待測蛋白的濃度。 優(yōu)點：操作簡便、快速、靈敏度高，準(zhǔn)確，試劑穩(wěn)定性 好，經(jīng)濟(jì)實用，抗干擾

8、能力強。,16,BCA蛋白質(zhì)檢測流程：,17,18,19,1.學(xué)習(xí)掌握BCA法測定蛋白質(zhì)濃度的 原理。 2.掌握721型分光光度計的使用。 3.了解蛋白質(zhì)測定的多種方法，并比較其優(yōu)缺點。,實驗?zāi)康?20,實驗原理,BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）堿性條件下，蛋白將Cu+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。 BCA分子式：,21,原理圖：,22,實驗步驟,（一）實驗材料 1、器材 721型分光光度計、恒溫水浴箱、移液管、試管 2、試劑 (1)試劑A:含1%BCA二鈉鹽、2%無水碳酸鈉、

9、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、0.95%碳酸氫鈉，將上述液體混合后調(diào)pH至11.25。 （2）試劑B：4%硫酸銅。 （3）BCA工作液：試劑A100mL+試劑B2L，混合。 （4）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1.5mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。 (5)待測樣品。,23,（二）操作,24,1、將上述各管混勻后于37C保溫30分鐘，用562nm波長比色測定吸光度值。 2、以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3、用測定管光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，再計算出待測血清中蛋白質(zhì)濃度（g/L)。,25,注意事項,1、紫外分光光度計的正確使用。 2、試劑的準(zhǔn)確量取，按操作表的順序依次添加試劑。 3、待測樣品濃度在502000微克毫升濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。 4、注意安全，保護(hù)好儀器。,26,1、試比較BCA法與雙縮脲、Lowry法的異同。 2、BCA法常用于科研，其有哪些特點。,思考,27,1）預(yù)熱儀器。 2）選定波長。 3）固定靈敏度檔。一般測量固定在“1”檔。 4）調(diào)節(jié)“0”點。 5）調(diào)節(jié)T=100。 6）測定。 7）關(guān)機(jī)。,紫外分光光度計的使用,28,下次實驗：