1、第十一章 固相膜免疫分析技術(shù),徐廣賢,目 錄,第一節(jié) 概 述 第二節(jié) 免疫層析試驗 第三節(jié) 免疫滲濾試驗 第四節(jié) 斑點酶免疫吸附試驗 第五節(jié) 免疫印跡試驗 第六節(jié) 影響固相膜免疫試驗的主要因素 第七節(jié) 固相膜免疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用,第一節(jié) 概 述,重點提示,固相膜免疫分析技術(shù) 常用的固相膜和標志物 固相膜的技術(shù)要求,固相膜免疫分析技術(shù),是以微孔膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測樣本后，經(jīng)微孔膜滲濾作用或毛細管虹吸作用使樣本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標記物或酶標記物與之反應(yīng)形成肉眼可見的顯色結(jié)果。,常用的固相膜,玻璃纖維素(fiberglass) 膜尼龍（ny

2、lon） 膜硝酸纖維素（nitrocell-ulose，NC)膜 NC膜或尼龍膜是常用的固相膜,常用的標志物,酶和有色微粒子 彩色膠乳 熒光素 膠體金和膠體硒等 其中以膠體金和熒光素最為常用,固相膜的技術(shù)要求,孔徑：穿流法的膜一般選擇0.4m左右；橫流法的膜可選擇5m10m。 流速：孔徑和分布結(jié)構(gòu)影響膜的流動速率，孔徑大，流速快。 蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強，以g/cm2表示。 均一性：優(yōu)質(zhì)的膜具有良好的均一性。,第二節(jié) 免疫層析試驗,重點提示,原理 常用的免疫層析試驗 膠體金免疫層析試驗的測定模式 熒光免疫層析試驗 技術(shù)要點,原 理,免疫層析試驗是以硝酸纖維素膜為固相載體，樣品溶液借助毛細作用

3、在層析條上泳動，同時樣品中的待測物與層析材料上待測物的受體（抗原或抗體）發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測帶），通過檢測標記物膠體金顆?；驘晒馑氐?，在短時間內(nèi)（20min)聚集而得到直觀的試驗結(jié)果（顯色）。,常用的免疫層析試驗,根據(jù)標記物的不同，免疫層析試驗可以分為： 膠體金免疫層析試驗：標記物為膠體金，多用于檢測抗原，但亦可用于檢測抗體。 熒光免疫層析試驗：標記物為熒光素，標記相應(yīng)的抗體或抗原，然后利用熒光檢測儀檢測試劑條上富集的反應(yīng)結(jié)合物激發(fā)產(chǎn)生的熒光強度，從而對標記物濃度進行檢測的一種方法。,膠體金免疫層析試驗的測定模式,雙抗體夾

4、心法檢測大分子抗原 競爭法檢測小分子抗原 間接法,雙抗體夾心法檢測大分子抗原,G處為金標特異性抗體，T處為包被特異性抗體，C處為包被抗免疫球蛋白抗體，B處為吸水紙。測試時A端滴加待測標本，通過層析作用，待測標本向B端移動，流經(jīng)G處時將金標抗體復(fù)溶，若待測標本中含待測抗原，即形成金標抗體-抗原復(fù)合物，移至T區(qū)時，形成金標抗體-抗原-抗體復(fù)合物，金標抗體被固定下來，在T區(qū)顯示紅色線條，呈陽性反應(yīng)，多余的金標記抗體移至C區(qū)被抗金標抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色質(zhì)控線條。,圖11-1 免疫層析試驗雙抗體夾心法原理示意圖,競爭法檢測小分子抗原,圖11-2 免疫層析試驗競爭法原理示意圖,G處為金標抗體，T處包被標準抗

5、原，C處包被抗金標抗體，測試時待測標本加于A端，若待測標本中含有待測抗原，流經(jīng)G處時結(jié)合金標抗體，當混合物移至T處時，因無足夠游離的金標抗體與膜上標準抗原結(jié)合，T處無紅色線條出現(xiàn)，實驗結(jié)果為陽性，游離金標抗體或金標抗體復(fù)合物流經(jīng)C處，與該處的抗金標抗體結(jié)合出現(xiàn)紅色的質(zhì)控帶，若標本中不含待測抗原，金標抗體則與T處膜上的標準抗原結(jié)合，在T處出現(xiàn)紅色的線條，實驗結(jié)果為陰性。,間接法,利用間接法檢測抗體時，待測血清標本中大量的非特異性IgG可以與特異性IgG競爭性結(jié)合膠體金標記的抗人IgG，從而影響試驗的敏感性，為了消除其影響，常采用反流免疫層析法排除非特異性抗體對測試的干擾。,熒光免疫層析試驗,熒光

6、免疫層析試驗是在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用熒光素標記相應(yīng)的抗體或抗原，然后利用熒光檢測儀檢測試劑條上富集的反應(yīng)結(jié)合物激發(fā)產(chǎn)生的熒光強度，從而對標記物濃度進行檢測的一種方法。熒光免疫層析實驗與膠體金免疫層析實驗的基本步驟是一樣的，但所用的標記物不一樣，前者采用的是熒光素，后者采用的是膠體金。常用的方法有夾心法、競爭法等。,技術(shù)要點,膠體金層析試驗：加樣、結(jié)果判定。 熒光層析試驗：不同的熒光標記物具有不同的檢測波長，需根據(jù)試劑盒的熒光標記物的特性，選擇合適的檢測波長，或使用試劑盒提供的專用熒光檢測儀器。,第三節(jié) 免疫滲濾試驗,重點提示,原理 測定模式 技術(shù)要點,原 理,DIGFA是將抗原或抗體點加

7、在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制成抗原或抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上，依次在膜上滴加樣品、免疫膠體金及洗滌液等試劑并與硝酸纖維素膜上的相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，起到親和層析的濃縮作用，達到快速檢測的目的?？乖贵w反應(yīng)后，形成大分子膠體金復(fù)合物，從而使陽性結(jié)果在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。,測定模式,1.雙抗體夾心法測抗原：,包被抗體的試紙,滴加金標抗體,滴加待檢樣品于試紙上,測定模式,2.間接法測特異性抗體：,試劑盒組成,主要由滲濾裝置、膠體金標記物、洗滌液、抗原參照品或抗體陽性對照品四部分組成。其中滲濾裝置是由塑料小盒、吸水墊料和已點加抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。試劑盒一般都設(shè)有質(zhì)控點，

8、質(zhì)控點的大小或形狀都不同于檢測點，有的用大小點區(qū)分、有的用點橫線區(qū)分，有的用橫豎線區(qū)分。,圖11-3 DIGFA結(jié)構(gòu)示意圖,技術(shù)要點,加 樣：將滲濾裝置平放于實驗臺面上，于小孔內(nèi)依次滴加含待測樣品及相應(yīng)的試劑。 結(jié)果判定：在膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點者判為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。斑點呈色的深淺相應(yīng)地表示陽性反應(yīng)的強弱。,第四節(jié) 斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗,重點提示,原理 技術(shù)要點 方法學評價,原 理,Dot-ELISA的實驗原理與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于Dot-ELISA所用載體為NC膜。其原理為樣品中的抗體或抗原與預(yù)先包被在NC膜上的抗原或抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，然后再加入相應(yīng)的酶

9、標二抗進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過酶催化底物，形成有色的沉淀物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，根據(jù)染色條帶或斑點的有無或深淺，對抗體或抗原進行檢測。陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色條帶或斑點。,圖11-4 Dot-ELISA示意圖,技術(shù)要點,抗原包被：優(yōu)化抗原的濃度。 抗原抗體反應(yīng)：滴加樣品血清，待檢抗體與NC膜上抗原結(jié)合。 確定酶結(jié)合物最佳稀釋度：一般以陰性樣品不顯色而陽性樣品顯色最強的酶結(jié)合物稀釋度為最佳稀釋度。 顯色反應(yīng)：在鹽酸聯(lián)苯胺和過氧化氫為底物時，溶液pH值應(yīng)在5.86.0，此時反應(yīng)最靈敏。,方法學評價,優(yōu)點： 1.吸附蛋白能力強 2.可同時檢測多種抗體 3.其它：實驗和結(jié)果判斷不需特殊設(shè)備條件，結(jié)果可長期保存,第五節(jié) 免疫印跡試驗,重點提示,原理 技術(shù)要點 方法學評價,原 理,技術(shù)要點,方法學評價,第六節(jié) 影響固相膜免疫試驗的主要因素,重點提示,試劑方面 標本方面 實驗過程,影響因素：試劑,試劑的選擇：注意試劑的注冊號、批號、有效期和檢驗合格證等；不同批號的試劑不能混用；不能使用過期的試劑。 試劑的準備：試劑在開封前應(yīng)檢查是否漏液、漏氣；使用前要在室溫（1825）下平衡20min30min。,影響因素：標本,標本處理：臨床檢測的標本有痰液、尿液、